音響流体マイクロデバイスに基づく細胞・核の圧縮率測定
Summary
ここでは、音響流体マイクロデバイスに基づいて細胞または核の圧縮率を測定するための高速で非破壊的なシステムを構築するためのプロトコルが提示されます。上皮間葉転換または電離放射線照射後の腫瘍細胞の機械的特性の変化を調べ、科学的研究および臨床診療におけるこの方法の適用の見通しを実証した。
Abstract
細胞力学は、腫瘍の転移、細胞の悪性化、および放射線感受性において重要な役割を果たします。これらのプロセスの間、細胞の機械的特性を研究することはしばしば困難です。圧縮や延伸などの接触に基づく従来の測定方法は、細胞損傷を引き起こしやすく、測定精度とその後の細胞培養に影響を与えます。接着状態での測定は、電離放射線が細胞を平らにし、接着性を高めるため、特に照射後の精度にも影響を与える可能性があります。ここでは、音響流体法に基づく細胞力学測定システムが開発されている。細胞圧縮率は、音響力の作用下での細胞運動軌跡を記録することによって得ることができ、中断状態での高速かつ非破壊測定を実現することができる。このホワイトペーパーでは、チップ設計、サンプル調製、軌道記録、パラメータ抽出、および分析のプロトコルについて詳しく説明します。異なる種類の腫瘍細胞の圧縮率をこの方法に基づいて測定した。核の圧縮率の測定は、圧電セラミックの共振周波数とマイクロチャネルの幅を調整することによっても達成されました。免疫蛍光実験の分子レベルの検証と組み合わせて、薬物誘発上皮間葉転換(EMT)前後の細胞圧縮率を比較した。さらに、異なる線量でX線照射した後の細胞圧縮率の変化を明らかにした。本稿で提案する細胞力学測定法は普遍的かつ柔軟であり、科学研究や臨床現場での応用が見込まれる。
Introduction
細胞の機械的特性は、腫瘍の転移、細胞の悪性形質転換、および放射線感受性において重要な役割を果たします1,2。上記のプロセスにおける細胞の機械的特性の役割を深く理解するには、細胞力学の正確な測定が重要であり、測定はその後の培養および分析のために細胞に損傷を与えてはなりません。測定プロセスは可能な限り速くなければなりません、さもなければ細胞が長期間培養環境から取り除かれるならば、細胞の生存率は影響を受けるかもしれません。
既存の細胞力学測定法にはいくつかの制限があります。磁気ツイストサイトメトリー、磁気ピンセット、粒子追跡マイクロレオロジーなどのいくつかの方法は、細胞への粒子の導入による細胞損傷を引き起こします3,4,5。原子間力顕微鏡(AFM)、マイクロピペット吸引、マイクロ狭窄、平行平板法など、細胞との接触によって測定する方法も細胞損傷を起こしやすく、スループットを向上させることは困難です6,7,8。さらに、電離放射線は細胞を平らにし、それらの接着を増加させます9;したがって、懸濁液中の全細胞力学を測定する必要があります。
以上の課題に応えて、音響流体法10,11,12,13,14に基づく細胞力学計測システムが開発された。チャネル幅は音響半波長に一致しているため、マイクロチャネルの正中線に定在波ノードが作成されます。音響放射力の作用下で、セルまたは標準ビーズは音圧ノードに移動できます。標準ビーズの物理的特性(サイズ、密度、圧縮率)がわかっているため、音響エネルギー密度を決定することができます。そして、細胞圧縮率は、音場における細胞の運動軌跡を記録することによって得ることができる。懸濁状態の細胞の非破壊ハイスループット測定を達成することができる。本稿では、マイクロ流体チップの設計、システムの構築、測定手順について紹介する。本方法の正確性を検証するために、様々な種類の腫瘍細胞の測定が行われている。この方法は、圧電セラミックスの共鳴周波数とマイクロチャネルの幅を調整することにより、細胞内構造(核など)に適用範囲を拡大していました。さらに、異なる線量での薬物誘発EMTまたはX線照射後の細胞圧縮率の変化を調べた。結果は、生化学的変化と細胞の機械的特性との相関を研究するための強力なツールとしてのこの方法の幅広い適用性を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
一般的に使用される細胞力学測定方法は、AFM、マイクロピペット吸引、マイクロ流体法、平行平板技術、光ピンセット、光学ストレッチャー、および音響法である20。マイクロフルイディクス法は、マイクロくびれ、伸長流、せん断流の3つのアプローチで機能します。その中で、光学ストレッチャー、光ピンセット、音響法、伸長流、およびせん断流のアプローチは非接触?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号12075330およびU1932165)および中国広東省自然科学財団(助成金番号2020A1515010270)の支援を受けました。
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
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