Akustoakışkan Mikrocihaz Temelinde Hücre ve Çekirdeğin Sıkıştırılabilirliğinin Ölçülmesi
Summary
Burada, akustoakışkan mikrocihaza dayalı hücre veya çekirdek sıkıştırılabilirliğini ölçmek için hızlı ve tahribatsız bir sistem oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Epitelyal-mezenkimal geçiş veya iyonlaştırıcı radyasyon sonrası tümör hücrelerinin mekanik özelliklerinde meydana gelen değişiklikler araştırılarak bu yöntemin bilimsel araştırma ve klinik pratikte uygulama olasılığı ortaya konmuştur.
Abstract
Hücre mekaniği tümör metastazında, hücrelerin malign transformasyonunda ve radyosensitivitede önemli rol oynamaktadır. Bu işlemler sırasında, hücrelerin mekanik özelliklerini incelemek genellikle zordur. Sıkıştırma veya germe gibi temasa dayalı geleneksel ölçüm yöntemleri, hücre hasarına neden olmaya, ölçüm doğruluğunu ve ardından hücre kültürünü etkilemeye eğilimlidir. Yapışkan durumdaki ölçümler, özellikle ışınlamadan sonra doğruluğu da etkileyebilir, çünkü iyonlaştırıcı radyasyon hücreleri düzleştirir ve yapışmayı arttırır. Burada akustoakışkan yönteme dayalı bir hücre mekaniği ölçüm sistemi geliştirilmiştir. Hücre sıkıştırılabilirliği, askıya alınmış durumda hızlı ve tahribatsız ölçüm yapabilen akustik kuvvetin etkisi altında hücre hareket yörüngesinin kaydedilmesiyle elde edilebilir. Bu yazıda çip tasarımı, numune hazırlama, yörünge kaydı, parametre çıkarma ve analiz protokolleri ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Farklı tipte tümör hücrelerinin sıkıştırılabilirliği bu yönteme dayanarak ölçüldü. Çekirdeğin sıkıştırılabilirliğinin ölçülmesi, piezoelektrik seramiğin rezonans frekansını ve mikrokanalın genişliğini ayarlayarak da sağlandı. İmmünofloresan deneylerinin moleküler düzeyde doğrulanması ile birlikte, ilaca bağlı epitelden mezenkimal geçişe (EMT) öncesi ve sonrası hücre sıkıştırılabilirliği karşılaştırıldı. Ayrıca, farklı dozlarda X-ışını ışınlamasından sonra hücre sıkıştırılabilirliğinin değişmesi ortaya çıkmıştır. Bu yazıda önerilen hücre mekaniği ölçüm yöntemi evrensel ve esnektir ve bilimsel araştırma ve klinik uygulamada geniş uygulama beklentilerine sahiptir.
Introduction
Hücre mekanik özellikleri tümör metastazında, hücrelerin malign transformasyonunda ve radyosensitivitede önemli rol oynar 1,2. Yukarıdaki süreçte hücre mekanik özelliklerinin rolünü derinlemesine anlamak için, hücresel mekaniğin doğru ölçümü kritik öneme sahiptir ve ölçüm, sonraki kültür ve analiz için hücrelere zarar vermemelidir. Ölçüm işlemi mümkün olduğunca hızlı olmalıdır, aksi takdirde hücreler yetiştirme ortamından uzun süre çıkarılırsa hücre canlılığı etkilenebilir.
Mevcut hücre mekaniği ölçüm yöntemleri bazı sınırlamalarla karşı karşıyadır. Manyetik bükümlü sitometri, manyetik cımbız ve parçacık izleme mikroreolojisi gibi bazı yöntemler, parçacıkların hücrelere girmesi nedeniyle hücre hasarına neden olur 3,4,5. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), mikropipet aspirasyonu, mikro daralma ve paralel plaka tekniği gibi hücrelerle temas yoluyla ölçüm yapan yöntemler de hücre hasarına eğilimlidir ve verimin 6,7,8 oranında artması zordur. Ek olarak, iyonlaştırıcı radyasyon hücreleri düzleştirecek ve yapışmalarını artıracaktır9; bu nedenle süspansiyondaki tüm hücre mekaniğini ölçmek gerekir.
Yukarıdaki zorluklara yanıt olarak, akustoakışkan yöntem10,11,12,13,14’e dayanan bir hücre mekaniği ölçüm sistemi geliştirilmiştir. Kanal genişliği akustik yarım dalga boyuna eşleştirilir, böylece mikrokanalın orta hattında durağan bir dalga düğümü oluşturulur. Akustik radyasyon kuvvetinin etkisi altında, hücreler veya standart boncuklar akustik basınç düğümüne hareket edebilir. Standart boncukların fiziksel özellikleri (boyut, yoğunluk ve sıkıştırılabilirlik) bilindiğinden, akustik enerji yoğunluğu belirlenebilir. Daha sonra, akustik alandaki hücrelerin hareket yörüngelerinin kaydedilmesiyle hücre sıkıştırılabilirliği elde edilebilir. Süspansiyon durumundaki hücrelerin tahribatsız yüksek verimli ölçümü sağlanabilir. Bu yazıda mikroakışkan çipin tasarımı, sistemin kurulması ve ölçüm adımları tanıtılacaktır. Yöntemin doğruluğunu doğrulamak için çeşitli tümör hücrelerinin ölçümü yapılmıştır. Bu yöntemin uygulama kapsamı, piezoelektrik seramiğin rezonans frekansı ve mikrokanalın genişliği ayarlanarak hücre altı yapılara (çekirdek gibi) genişletilmiştir. Ek olarak, ilaca bağlı EMT veya farklı dozlarda X-ışını ışınlamasından sonra hücre sıkıştırılabilirliğindeki değişiklikler araştırılmıştır. Sonuçlar, bu yöntemin biyokimyasal değişiklikler ve hücresel mekanik özellikler arasındaki korelasyonu incelemek için güçlü bir araç olarak geniş uygulanabilirliğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaygın olarak kullanılan hücre mekaniği ölçüm yöntemleri AFM, mikropipet aspirasyonu, mikroakışkanlar yöntemleri, paralel plaka tekniği, optik cımbız, optik sedye ve akustik yöntemlerdir20. Mikroakışkanlar yöntemleri üç yaklaşımla çalışabilir: mikro daralma, uzatma akışı ve kesme akışı. Bunlar arasında optik sedye, optik cımbız, akustik yöntemler, ekstansiyonel akış ve kesme akışı yaklaşımları temassız ölçümlerdir. Temas ölçümlerinin aksine, temass…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe numaraları 12075330 ve U1932165) ve Çin’in Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe numarası 2020A1515010270) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
References
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
- Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
- Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
- Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
- Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
- Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Jung, J. -. W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
- Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
- Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
- Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
- Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
- Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
- Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
- Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
- Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
- Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
- Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
- Wei, M. -. T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
- Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
- Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
- Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
- Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).
