Vurdering av intestinal transcytose av neonatal Escherichia coli bakteriemi isolater

Summary

Escherichia coli forårsaker sepsis hos nyfødte som inntar bakteriene rundt fødselen. Prosessen involvert i E. colis evne til å reise fra enterisk kanal til blodet er dårlig forstått. Denne in vitro-modellen vurderer evnen til E. coli-stammer til å reise gjennom tarmepitelcellene.

Abstract

Nyfødte inntar mors E. coli-stammer som koloniserer tarmkanalen rundt leveringstidspunktet. E. coli-stammer med evnen til å translokere over tarmen invaderer den nyfødte blodet, forårsaker livstruende bakteriemi. Metodikken som presenteres her benytter polariserte tarmepitelceller dyrket på semipermeable innsatser for å vurdere transcytose av neonatale E. coli-bakteriemiisolater in vitro. Denne metoden bruker den etablerte T84 tarmcellelinjen som har evnen til å vokse til sammenløp og danne tette kryss og desmosomer. Etter å ha nådd sammenløp utvikler modne T84 monolag transepitelresistens (TEER), som kan kvantifiseres ved hjelp av et voltmeter. TEER-verdiene er omvendt korrelert med den paracellulære permeabiliteten til ekstracellulære komponenter, inkludert bakterier, over tarmmonolaget. Den transcellulære passasjen av bakterier (transcytose) endrer derimot ikke nødvendigvis TEER-målingene. I denne modellen kvantifiseres bakteriell passasje over tarmmonolaget i opptil 6 timer etter infeksjon, og gjentatte målinger av TEER gjøres for å overvåke den paracellulære permeabiliteten. I tillegg letter denne metoden bruken av teknikker som immunostaining for å studere strukturelle endringer i tette kryss og andre celle-til-celle-adhesjonsproteiner under bakteriell transcytose over det polariserte epitelet. Bruken av denne modellen bidrar til karakterisering av mekanismene der neonatal E. coli transcytose over tarmepitelet for å produsere bakteriemi.

Introduction

Escherichia coli er den vanligste årsaken til tidlig begynnende sepsis hos nyfødte ^1,2,3. Dødeligheten av neonatal E. coli-bakteriemi kan nå 40%, og meningitt er en mulig komplikasjon som er forbundet med alvorlige nevrodevelopmental funksjonshemninger². Inntak av mors E. coli-stammer av nyfødte kan produsere neonatal bakteriemi; Denne prosessen har blitt replikert i dyremodeller ^2,4. Når de er inntatt, reiser patogene bakterier fra neonatal tarmlumen over tarmbarrieren og går inn i blodet og forårsaker septikemi. Neonatale invasive E. coli-stammer som produserer bakteriemi varierer i deres evne til å invadere tarmepitelceller ^1,5. Imidlertid har deres evne til å transcytose tarmepitelet etter invasjon ikke blitt fullstendig karakterisert.

Denne intestinale transcytosemodellen er en nyttig in vitro-metode for å etterligne bakteriell passasje over tarmepitelet. Det overordnede målet med metodene som presenteres i dette manuskriptet er å sammenligne neonatale E. coli-isolaters evne til å transcytose tarmepitelet. Modellen beskrevet her benytter T84-celler, som er udødeliggjorte humane intestinale adenokarsinomceller ^6,7. T84-celler dyrkes for å konfluens på en semipermeabel membran med to separate rom. Begrunnelsen for å bruke denne teknikken er at, som det skjer in vivo, polariserer disse tarmcellene og utvikler modne tette kryss ^6,8. Siden i kontakt med membranen blir basalsiden. Den motsatte siden av cellene blir den apikale siden, som ligner tarmlumen hvor inntatte patogener holder seg og invaderer. Transwellmembranen er gjennomtrengelig for bakterier, men de polariserte tarmcellene danner tette kryss, noe som svekker bakteriell paracellulær bevegelse⁹. Dermed gir denne metoden fordelen av et kontrollert in vitro-miljø som bruker en human cellelinje for å studere prosessen med bakteriell transcytose, inkludert den transcellulære ruten. Mens det finnes andre metoder for å undersøke transcytose av bakterier over tarmepitelet, gir transwell-metoden som presenteres her større letthet og tilgjengelighet. Alternative teknikker, for eksempel de som bruker ex vivo-prøver satt opp i Ussing-kammersystemer, er tilgjengelige. Imidlertid bruker de vevsprøver som kanskje ikke er lett tilgjengelige, spesielt hvis forskningen har til hensikt å studere menneskelig fysiologi¹⁰. Tarmorganoider representerer et annet eksempel på et in vitro-alternativ for å studere verts-bakterieinteraksjoner¹¹. Mens organoide monolag også kan brukes i transwell-systemet for å studere bakteriell transcytose, krever de isolasjon og vekst av stamceller og bruk av spesifikke vekstfaktorer for å indusere differensiering¹². Dermed er bruken av dem mer tidkrevende og forbundet med større kostnader sammenlignet med transwell-metoden beskrevet i dette manuskriptet.

Vurderingen av bakteriell passasje over tarmepitelet ved bruk av dette in vitro transwell-systemet har blitt utført for forskjellige patogener. Disse studiene har vist nytten av transwell-systemet ved bruk av T84-celler for å karakterisere transcytose av bakterier over det polariserte tarmepitelet^13,14,15. Anvendelsen av denne transwellmetoden for å sammenligne transcytoseevnen til bakteriemiproduserende neonatale E. coli-stammer er imidlertid ikke beskrevet i detalj. Dette manuskriptet gir andre forskere en standard transwellprotokoll som er pålitelig og enkel å bruke og ikke krever ressurser som er for dyre.

For å sammenligne evnen til neonatale invasive E. coli-stammer til å transcytose tarmepitelet, kan den apikale siden av tarmepitelmonolaget infiseres med et kjent antall bakterieceller. Etter inkubasjon kan mediet på basalsiden av epitelet samles og bakteriene kvantifiseres for å bestemme mengden bakteriell transcytose over tid. I dette manuskriptet brukes metodene som presenteres for å studere transcytoseevnen til neonatale E. coli kliniske stammer gjenopprettet fra nyfødte innlagt på sykehus med bakteriemi. Inklusjonskriteriene for utvelgelse av disse neonatale kliniske isolatene for transcytosestudier er tidligere publisert ^1,2,16. Når denne metoden utføres ved bruk av forskjellige E. coli-stammer, kan deres transcytose evner sammenlignes. Gjennom denne prosessen gir tarmtranscytosemodellen verdifulle data for å karakterisere virulensfaktorene til E. coli som bidrar til flertrinnsprosessen som kulminerer i utviklingen av neonatal bakteriemi.

Protocol

MERK: Utfør alle manipulasjoner av T84-celler, bakterier, plater og reagenser i et sikkerhetsskap på biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) for å unngå forurensning. Bruk separate områder og inkubatorer for alt arbeid som involverer sterile T84-celler, infiserte T84-celler og E. coli. De kliniske E. coli-isolatene som ble testet med metodene beskrevet her, ble oppnådd i henhold til retningslinjene fra Institutional Review Board ved vår institusjon 1,16.<…

Representative Results

Figur 1: T84 TEER over tid. Når T84-cellelaget modnes på innsatsen, øker monolagets elektriske motstand. Ved en TEER på minst 1000 Ω·cm2 er cellelaget tilstrekkelig utviklet til å redusere den paracellulære bakterietransporten og tillate måling av primært transcellulær bakteriell transitt. Feilfeltene angir standardavviket. <a …

Discussion

Denne metoden er avledet fra teknikker som brukes i gastroenterologi og smittsomme sykdommer²⁰. In vitro-modeller av tarmepitelbarrieren har blitt brukt til å belyse mekanismene der luminalinnholdet interagerer med denne relevante komponenten av medfødt immunitet ^6,8. Vertspatogeninteraksjonene til invasiv neonatal E. coli har også blitt separat karakterisert gjennom genetisk analyse, studier av antimikrobiell resisten…

Materials

10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL sterile conical tubes	MidSci	C15B
2 mL microcentrifuge tubes	Avant	AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Aspirator	Corning	4930
Biosafety Cabinets	Labconco	30441010028343	Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Disposable inoculation loops	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11765-047
Hemacytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubator shaker	New Brunswick	Innova 4080
Incubators	Thermo Scientific	51030284	Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth	Difco	244610
Lysogeny broth agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope	Nikon
Spectrophotometer	Unico	1100RS
T84 Intestinal Cells	American Tissue Culture Collection	CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format	Falcon	353096
Tissue culture plate, 24 wells	Falcon	353504
Trypan blue stain	Fisher Scientific	T10282