Valutazione della transcitosi intestinale degli isolati neonatali di batteriemia di Escherichia coli

Summary

Escherichia coli provoca sepsi nei neonati che ingeriscono i batteri intorno al momento della nascita. Il processo coinvolto nella capacità di E. coli di viaggiare dal tratto enterico al flusso sanguigno è poco compreso. Questo modello in vitro valuta la capacità dei ceppi di E. coli di viaggiare attraverso le cellule epiteliali intestinali.

Abstract

I neonati ingeriscono ceppi materni di E. coli che colonizzano il loro tratto intestinale intorno al momento del parto. I ceppi di E. coli con la capacità di traslocare attraverso l’intestino invadono il flusso sanguigno del neonato, causando batteriemia pericolosa per la vita. La metodologia qui presentata utilizza cellule epiteliali intestinali polarizzate cresciute su inserti semipermeabili per valutare la transcitosi degli isolati neonatali di batteriemia di E. coli in vitro. Questo metodo utilizza la linea cellulare intestinale T84 stabilita che ha la capacità di crescere fino alla confluenza e formare giunzioni strette e desmosomi. Dopo aver raggiunto la confluenza, i monostrati maturi T84 sviluppano resistenza transepiteliale (TEER), che può essere quantificata utilizzando un voltmetro. I valori di TEER sono inversamente correlati con la permeabilità paracellulare dei componenti extracellulari, compresi i batteri, attraverso il monostrato intestinale. Il passaggio transcellulare dei batteri (transcitosi), d’altra parte, non altera necessariamente le misurazioni TEER. In questo modello, il passaggio batterico attraverso il monostrato intestinale viene quantificato fino a 6 ore dopo l’infezione e vengono effettuate misurazioni ripetute di TEER per monitorare la permeabilità paracellulare. Inoltre, questo metodo facilita l’uso di tecniche come l’immunocolorazione per studiare i cambiamenti strutturali nelle giunzioni strette e altre proteine di adesione cellula-cellula durante la transcitosi batterica attraverso l’epitelio polarizzato. L’uso di questo modello contribuisce alla caratterizzazione dei meccanismi attraverso i quali E. coli neonatale transcitosi attraverso l’epitelio intestinale per produrre batteriemia.

Introduction

L’Escherichia coli è la causa più comune di sepsi ad esordio precoce nei neonati ^1,2,3. Il tasso di mortalità della batteriemia neonatale di E. coli può raggiungere il 40% e la meningite è una possibile complicanza associata a gravi disabilità dello sviluppo neurologico². L’ingestione di ceppi materni di E. coli da parte del neonato può produrre batteriemia neonatale; Questo processo è stato replicato in modelli animali ^2,4. Una volta ingeriti, i batteri patogeni viaggiano dal lume intestinale neonatale attraverso la barriera intestinale ed entrano nel flusso sanguigno, causando setticemia. I ceppi neonatali invasivi di E. coli che producono batteriemia variano nella loro capacità di invadere le cellule epiteliali intestinali ^1,5. Tuttavia, la loro capacità di transcitare l’epitelio intestinale dopo l’invasione non è stata completamente caratterizzata.

Questo modello di transcitosi intestinale è un utile metodo in vitro per emulare il passaggio batterico attraverso l’epitelio intestinale. L’obiettivo generale dei metodi presentati in questo manoscritto è quello di confrontare la capacità degli isolati neonatali di E. coli di transcitare l’epitelio intestinale. Il modello qui descritto utilizza cellule T84, che sono cellule di adenocarcinoma intestinale umano immortalizzate ^6,7. Le cellule T84 vengono coltivate fino alla confluenza su una membrana semipermeabile con due compartimenti separati. Il razionale per l’utilizzo di questa tecnica è che, come accade in vivo, queste cellule intestinali si polarizzano e sviluppano giunzioni strette mature ^6,8. Il lato a contatto con la membrana diventa il lato basale. Il lato opposto delle cellule diventa il lato apicale, simile al lume intestinale dove i patogeni ingeriti aderiscono e invadono. La membrana transwell è permeabile ai batteri, ma le cellule intestinali polarizzate formano giunzioni strette, che compromettono il movimento paracellulare batterico⁹. Pertanto, questo metodo offre il vantaggio di un ambiente controllato in vitro che utilizza una linea cellulare umana per studiare il processo di transcitosi batterica, compresa la via transcellulare. Mentre esistono altri metodi per studiare la transcitosi dei batteri attraverso l’epitelio intestinale, il metodo transwell qui presentato offre maggiore facilità e accessibilità. Sono disponibili tecniche alternative, come quelle che utilizzano campioni ex vivo installati nei sistemi di camere di Ussing. Tuttavia, utilizzano campioni di tessuto che potrebbero non essere facilmente accessibili, in particolare se la ricerca intende studiare la fisiologia umana¹⁰. Gli organoidi intestinali rappresentano un altro esempio di alternativa in vitro per lo studio delle interazioni ospite-batteri¹¹. Mentre i monostrati organoidi possono anche essere utilizzati nel sistema transwell per studiare la transcitosi batterica, richiedono l’isolamento e la crescita delle cellule staminali e l’uso di specifici fattori di crescita per indurre la differenziazione¹². Pertanto, il loro uso è più dispendioso in termini di tempo e associato a costi maggiori rispetto al metodo transwell descritto in questo manoscritto.

La valutazione del passaggio batterico attraverso l’epitelio intestinale utilizzando questo sistema transwell in vitro è stata eseguita con successo per vari agenti patogeni. Questi studi hanno dimostrato l’utilità del sistema transwell utilizzando cellule T84 per caratterizzare la transcitosi dei batteri attraverso l’epitelio intestinale polarizzato^13,14,15. Tuttavia, l’applicazione di questo metodo transwell per confrontare la capacità di transcitosi dei ceppi neonatali di E. coli produttori di batteriemia non è stata descritta in dettaglio. Questo manoscritto fornisce ad altri ricercatori un protocollo transwell standard che è affidabile e facile da usare e non richiede risorse troppo costose.

Per confrontare la capacità dei ceppi neonatali invasivi di E. coli di transcitare l’epitelio intestinale, il lato apicale del monostrato epiteliale intestinale può essere infettato da un numero noto di cellule batteriche. Dopo l’incubazione, il mezzo sul lato basale dell’epitelio può essere raccolto e i batteri quantificati per determinare la quantità di transcitosi batterica nel tempo. In questo manoscritto, i metodi presentati sono utilizzati per studiare la capacità di transcitosi di ceppi clinici neonatali di E. coli recuperati da neonati ospedalizzati con batteriemia. I criteri di inclusione per la selezione di questi isolati clinici neonatali per gli studi di transcitosi sono stati pubblicati in precedenza ^1,2,16. Quando questo metodo viene eseguito utilizzando diversi ceppi di E. coli, le loro capacità di transcitosi possono essere confrontate. Attraverso questo processo, il modello di transcitosi intestinale fornisce dati preziosi per caratterizzare i fattori di virulenza di E. coli che contribuiscono al processo multifase che culmina nello sviluppo della batteriemia neonatale.

Protocol

NOTA: Eseguire tutte le manipolazioni delle cellule T84, dei batteri, delle piastre e dei reagenti in un armadio di sicurezza di livello 2 (BSL-2) per evitare la contaminazione. Utilizzare aree separate e incubatori per tutto il lavoro che coinvolge cellule T84 sterili, cellule T84 infette ed E. coli. Gli isolati clinici di E. coli testati con i metodi qui descritti sono stati ottenuti seguendo le linee guida dell’Institutional Review Board presso il nostro istituto 1,16</su…

Representative Results

Figura 1: T84 TEER nel tempo. Man mano che lo strato di celle T84 matura sull’inserto, la resistenza elettrica del monostrato aumenta. Con un TEER di almeno 1.000 Ω·cm2, lo strato cellulare è sufficientemente sviluppato per diminuire il trasporto batterico paracellulare e consentire la misurazione del transito batterico principalmente …

Discussion

Questo metodo deriva da tecniche utilizzate in gastroenterologia e malattie infettive²⁰. Modelli in vitro della barriera epiteliale intestinale sono stati utilizzati per chiarire i meccanismi attraverso i quali i contenuti luminali interagiscono con questa componente rilevante dell’immunità innata ^6,8. Le interazioni ospite-patogeno di E. coli neonatale invasivo sono state anche caratterizzate separatamente attraverso an…

Materials

10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL sterile conical tubes	MidSci	C15B
2 mL microcentrifuge tubes	Avant	AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Aspirator	Corning	4930
Biosafety Cabinets	Labconco	30441010028343	Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Disposable inoculation loops	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11765-047
Hemacytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubator shaker	New Brunswick	Innova 4080
Incubators	Thermo Scientific	51030284	Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth	Difco	244610
Lysogeny broth agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope	Nikon
Spectrophotometer	Unico	1100RS
T84 Intestinal Cells	American Tissue Culture Collection	CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format	Falcon	353096
Tissue culture plate, 24 wells	Falcon	353504
Trypan blue stain	Fisher Scientific	T10282