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Biochimie

Diffusione e assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate di polimeri

Published: July 19, 2022
doi:
10.3791/64243
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab,University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering,Indian Institute of Science

Summary

Qui viene presentato un protocollo per eseguire e analizzare il legame, la mobilità e l’assemblaggio di singole molecole su membrane lipidiche affollate artificiali utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale a singola molecola (smTIRF).

Abstract

Le membrane cellulari sono ambienti molto affollati per le reazioni biomolecolari e la segnalazione. Tuttavia, la maggior parte degli esperimenti in vitro che sondano l’interazione proteica con i lipidi impiegano membrane nude a doppio strato. Tali sistemi mancano delle complessità dell’affollamento da parte di proteine e glicani incorporati nella membrana ed escludono gli effetti di volume associati incontrati sulle superfici della membrana cellulare. Inoltre, la superficie di vetro caricata negativamente su cui si formano i doppi strati lipidici impedisce la libera diffusione delle biomolecole transmembrana. Qui, presentiamo una membrana polimero-lipidica ben caratterizzata come imitazione per membrane lipidiche affollate. Questo protocollo utilizza lipidi coniugati con glicole polietilenico (PEG) come approccio generalizzato per incorporare i crowder nel doppio strato lipidico supportato (SLB). In primo luogo, viene presentata una procedura di pulizia dei vetrini microscopici e dei vetrini per l’esecuzione di esperimenti a singola molecola. Successivamente, vengono discussi i metodi per caratterizzare i PEG-SLB ed eseguire esperimenti a singola molecola del legame, della diffusione e dell’assemblaggio di biomolecole utilizzando il tracciamento di singole molecole e il fotosbiancamento. Infine, questo protocollo dimostra come monitorare l’assemblaggio di nanopori della tossina batterica che forma i pori Citolisina A (ClyA) su membrane lipidiche affollate con analisi di fotosbiancamento a singola molecola. Sono inclusi anche codici MATLAB con set di dati di esempio per eseguire alcune delle analisi comuni come il tracciamento delle particelle, l’estrazione del comportamento diffusivo e il conteggio delle subunità.

Introduction

Le membrane cellulari sono sistemi altamente affollati e complessi1. L’affollamento molecolare può avere un impatto considerevole sulla diffusione di entità legate alla membrana come proteine e lipidi 2,3,4. Allo stesso modo, le reazioni bimolecolari sulle membrane lipidiche come la dimerizzazione dei recettori o l’oligomerizzazione dei complessi di membrana sono influenzate dall’affollamento 5,6,7. La natura, la configurazione e la concentrazione dei crowder possono governare il legame di membrana, la diffusività e l’interazione proteina-proteina in diversi modi 8,9. Poiché controllare l’affollamento delle membrane cellulari e interpretare la sua influenza sulle biomolecole incorporate è impegnativo, i ricercatori hanno cercato di stabilire sistemi alternativi in vitro 10.

Un approccio popolare per le membrane artificiali affollate è il drogaggio delle membrane a doppio strato con polimeri (come polietilenglicole, PEG) lipidi innestati11,12. Durante la visualizzazione della dinamica proteica e lipidica su doppi strati lipidici supportati (SLB), questi polimeri schermano ulteriormente i componenti incorporati nella membrana dal substrato sottostante caricato negativamente (come il vetro) sollevando efficacemente il doppio strato lontano dal supporto sottostante. Variando la dimensione e la concentrazione del polimero, è possibile controllare l’estensione dell’affollamento molecolare, nonché la sua separazione dal supporto solido sottostante13,14. Questo è chiaramente un vantaggio rispetto ai doppi strati lipidici supportati su substrati solidi senza cuscini polimerici15,16, dove le biomolecole transmembrana possono perdere la loro attività17,18,19. Ancora più importante, ci permette di ricapitolare l’ambiente affollato della membrana cellulare in vitro, che è fondamentale per molti processi di membrana.

Anche i polimeri innestati superficialmente sulle membrane subiscono cambiamenti nella loro configurazione a seconda della loro densità di innesto12. A basse concentrazioni, rimangono in una configurazione a spirale entropica, nota come fungo, sopra la superficie della membrana. Con l’aumentare della concentrazione, iniziano a interagire e tendono a srotolarsi ed estendersi, producendo infine una densa formazione simile a una spazzola sulla membrana21. Poiché la transizione dal fungo al regime del pennello è altamente eterogenea e si manifesta in condizioni scarsamente caratterizzate del polimero, è importante utilizzare condizioni ben caratterizzate per l’affollamento su membrane innestate in polimero. Rispetto ad un recente studio20, identifichiamo e riportiamo composizioni di membrana affollate che mantengono il trasporto diffusivo e l’attività delle biomolecole transmembrana.

In questo protocollo, discutiamo come generare membrane lipidiche PEGilate e forniamo raccomandazioni per le densità PEG che imitano l’affollamento in due diversi regimi di configurazione polimerica (vale a dire, funghi e spazzole). Il protocollo descrive anche il legame di singole molecole, il tracciamento delle particelle e l’acquisizione e l’analisi dei dati di photobleaching per le molecole incorporate in queste membrane affollate. In primo luogo, descriviamo le fasi di pulizia approfondite, l’assemblaggio della camera di imaging e la generazione di PEG-SLB. In secondo luogo, forniamo dettagli per il legame a singola molecola, il tracciamento delle particelle e gli esperimenti di fotosbiancamento. In terzo luogo, discutiamo i) estraendo le affinità di legame relative, ii) caratterizzando la diffusione molecolare e iii) contando le subunità in un assemblaggio proteico da film di singole molecole sulla membrana.

Mentre abbiamo caratterizzato questo sistema con l’imaging a singola molecola, il protocollo è utile per tutti i biofisici di membrana interessati a comprendere l’effetto dell’affollamento sulle reazioni biomolecolari sulle membrane lipidiche. Nel complesso, presentiamo una solida pipeline per la realizzazione di doppi strati lipidici affollati e supportati, insieme a vari saggi a singola molecola condotti su di essi e le corrispondenti routine di analisi.

Protocol

1. Pulizia del vetrino e del coprivetrino per esperimenti a singola molecola Prima dell’assemblaggio della camera di imaging, pulire e preparare sia i vetrini che i vetrini. Praticare più coppie di fori sui vetrini utilizzando una perforatrice con punte diamantate (0,5-1 mm di diametro). Se si utilizzano fogli acrilici, utilizzare un taglio laser per praticare fori precisi (0,5 mm), come mostrato nella Figura 1.NOTA: Ogni coppia di fori fungerà da ingresso e …

Representative Results

Monitoraggio del legame della proteina ClyA sulle membrane PEGilateDopo il passo 4.5, la cinetica di legame viene stimata tracciando il numero di particelle che si legano alla superficie della membrana nel tempo (Video 1). Quando la proteina ClyA si lega a una membrana con 5 mol% di lipidi PEG2000, la densità delle particelle aumenta e raggiunge la saturazione (Figura 5). Un decadimento esponenziale adattato alle particelle legate (cerchi ciano) fornisc…

Discussion

Qui, dimostriamo esperimenti a singola molecola su doppi strati lipidici supportati (SLB) che manifestano un ambiente affollato per le biomolecole incorporate nella membrana. L’ambiente affollato genera un effetto di volume escluso, portando al potenziamento delle reazioni biomolecolari 1,2,39,40. Per il sistema PEG-lipidico, in cui il polimero occupa principalmente il volume al di fuori del do…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono il Prof. Benjamin Schuler per aver condiviso l’espressione plasmide per la proteina ClyA. Questo lavoro è stato supportato dallo Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 – 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons
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Citer Cet Article
Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).
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