Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen
Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.
Abstract
Das Knochenmark (BM) ist das Weichgewebe in den Knochen, in dem hauptsächlich die Hämatopoese stattfindet, der Prozess, durch den neue Blutzellen gebildet werden. Als solches enthält es hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sowie unterstützende Stromazellen, die zur Aufrechterhaltung und Regulierung von HSPCs beitragen. Hämatologische und andere BM-Erkrankungen stören die Hämatopoese, indem sie hämatopoetische Zellen direkt und/oder durch die Veränderung der BM-Nische betreffen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Untersuchung der Hämatopoese in Gesundheit und Malignität durch die phänotypische Analyse von murinen BM-HSPCs und stromalen Nischenpopulationen mittels Durchflusszytometrie. Unsere Methode beschreibt die erforderlichen Schritte zur Anreicherung von BM-Zellen in endostealen und zentralen BM-Fraktionen sowie die geeigneten Gating-Strategien zur Identifizierung der beiden wichtigsten Nischenzelltypen, die an der HSPC-Regulation beteiligt sind, Endothelzellen und mesenchymale Stammzellen. Die hier vorgeschlagene phänotypische Analyse kann mit Mausmutanten, Krankheitsmodellen und funktionellen Assays kombiniert werden, um das HSPC-Kompartiment und seine Nische zu charakterisieren.
Introduction
Die Durchflusszytometrie ist eine unschätzbare Methode zur Charakterisierung und prospektiven Isolierung von Immun- und hämatopoetischen Zellen. Es wird auch zunehmend zur Analyse von Stroma- und Epithelpopulationen verschiedener Gewebe eingesetzt. Die hämatopoetische Stammzelle (HSC) hat einzigartige Eigenschaften der Selbsterneuerung und Multipotenz. Bei erwachsenen Säugetieren befinden sich HSZ hauptsächlich im Knochenmark (BM), wo sie Ruhe- und Überlebenssignale aus der umgebenden Mikroumgebung oder Nische1 erhalten. HSCs werden formal nach funktionellen Assays2 definiert. Nichtsdestotrotz haben mehrere wegweisende Arbeiten die Nützlichkeit der Durchflusszytometrie zur Identifizierung von HSZ gezeigt. Durch die Verwendung von begrenzten Zelloberflächenmarkern ist es möglich, hämatopoetische Populationen zu unterscheiden, die stark an HSZ angereichert sind3. Die Durchflusszytometrie ist daher eine zentrale Methode im Stammzellbereich. Es wurde ausgiebig verwendet, um den Einfluss von vermeintlichen Nischenzelltypen und Nischenfaktoren auf HSZ zu bewerten. Durch die Kombination von Durchflusszytometrie mit Bildgebung und funktionellen Assays konnte gezeigt werden, dass HSZ entscheidend durch perivaskuläre mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Endothelzellen (ECs) unterstützt werden. BM-MSCs sind eine heterogene Gruppe und haben unterschiedliche Zytokinbeiträge4, aber es ist allgemein bekannt, dass Leptinrezeptoren (LepR)+ MSCs wichtige Nischenzellen sind1. BM ECs sind ebenfalls sehr heterogen und können Teil von Sinusoiden, Arteriolen und Typ H/Übergangsgefäßensein 5. Verschiedene Studien haben den nuancierten Beitrag dieser verschiedenen ECs gezeigt. Zum Beispiel befinden sich endosteale sinusoidale ECs räumlich näher an ruhenden HSCs6, während nicht-migratorische HSCs mit geringeren Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies in der Nähe von arteriolären ECs7 lokalisiert sind. Die endosteale versus zentrale Lage von Nischen ist ebenfalls sehr wichtig. Endosteale Typ-H-Gefäße sind mit perivaskulären Stromazellen assoziiert, die mit zunehmendem Alter verloren gehen, was zum Verlust von HSZ führt8. Bei der akuten myeloischen Leukämie sind zentrale ECs erweitert, während endosteale Gefäße und endosteale HSZ verloren gehen9.
Die meisten Studien auf diesem Gebiet haben sich auf die Hämatopoese selbst und auf die extrinsische Regulation von HSZ durch die Zelle konzentriert. Es wurde jedoch zunehmend erkannt, dass es notwendig ist, die Nischen, die andere Vorläuferzellen regulieren, nämlich die multipotenten Vorläuferzellen (MPPs), besser zu charakterisieren, insbesondere wenn man bedenkt, dass sie die Haupttreiber der Hämatopoese im stationären Zustand sind10. Im Gegensatz zu einer festen hierarchischen Struktur haben neuere Studien gezeigt, dass die Hämatopoese ein Kontinuum ist, in dem sich HSZ in einem frühen Stadium zu verzerrten MPPs differenzieren11. MPPs wurden nach verschiedenen Klassifikationsschemata benannt12, aber ein kürzlich veröffentlichtes Konsensuspapier der Internationalen Gesellschaft für experimentelle Hämatologie (ISEH) schlug vor, MPPs als frühe MPPs und nach ihrer lymphoiden (MPP-Ly), megakaryozytären und erythroiden (MPP-Mk/E) und myeloischen (MPP-G/M) Bias zu unterscheiden13. Der Einsatz der Durchflusszytometrie wird entscheidend sein, um die Bedeutung von BM-Nischen für die Regulation dieser Populationen weiter zu untersuchen. Aktuelle Methoden der Durchflusszytometrie verwenden variable Gating-Strategien, um HSPCs zu differenzieren und Stromazellen, nämlich ECs, anhand inkonsistenter Marker zu identifizieren. Das Ziel der aktuellen Methode ist es, einen einfachen und reproduzierbaren Workflow der BM-Färbung zur Identifizierung von HSPC-Subpopulationen, heterogenen Gruppen von ECs und LepR+ MSCs zu präsentieren. Wir glauben, dass diese Technik, obwohl sie mit den zuvor beschriebenen Methoden vergleichbar ist (siehe z.B. Referenz 14), ein aktualisiertes und einfach zu implementierendes Protokoll für die phänotypische Analyse von hämatopoetischen Zellen in den beiden funktionellen Knochenmarkbereichen, endosteal und zentralem BM 8,15, sowie von BM-Stromanischenzellen bietet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während das beschriebene Protokoll einfach und leicht durchzuführen ist, sollte besonderen Wert auf bestimmte Schritte gelegt werden. Beispielsweise sollte bei der Gewinnung von gespültem BM (Schritt 5.2) das Volumen oder die Anzahl der Male, die angegeben sind, um PBS 2% FBS durch das Innere des zentralen Teils des Knochens zu passieren, nicht überschritten werden, da dies zu einer erheblichen Kontamination der gespülten Probe durch endosteale Zellpopulationen führen kann.
Änderungen a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LM wurde durch einen Zuschuss des Lady Tata Memorial Trust unterstützt. JR wurde durch ein Promotionsstipendium der Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT-Stipendium UI/BD/150833/2021). ML wurde durch ein PhD-Stipendium der FCT (FCT-Stipendium 2021.04773.BD) unterstützt. DD wurde durch Zuschüsse der American Society of Hematology, der Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) und der Portugiesischen Gesellschaft für Hämatologie unterstützt. Wir danken Dr. Catarina Meireles und Emilia Cardoso von der TRACY-Einrichtung bei i3s für die Unterstützung.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
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