Flowcytometrianalyse af murinknoglemarv, hæmatopoietisk stam- og stamceller og stromale nicheceller
Summary
Her beskriver vi en simpel protokol til isolering og farvning af murinknoglemarvsceller til fænotype hæmopoietiske stam- og stamceller sammen med de understøttende nicheendotel- og mesenkymale stamceller. En metode til at berige celler placeret i endosteale og centrale knoglemarvsområder er også inkluderet.
Abstract
Knoglemarven (BM) er det bløde væv, der findes i knogler, hvor hæmatopoiesis, den proces, hvorved nye blodlegemer genereres, primært forekommer. Som sådan indeholder den hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC’er) samt understøtter stromale celler, der bidrager til vedligeholdelse og regulering af HSPC’er. Hæmatologiske og andre BM-lidelser forstyrrer hæmatopoiesis ved at påvirke hæmatopoietiske celler direkte og / eller gennem ændring af BM-nichen. Her beskriver vi en metode til at studere hæmatopoiesis i sundhed og malignitet gennem fænotypisk analyse af murine BM HSPC’er og stromale nichepopulationer ved flowcytometri. Vores metode beskriver de nødvendige trin til at berige BM-celler i endosteale og centrale BM-fraktioner samt de passende gating-strategier til at identificere de to nøglenichecelletyper, der er involveret i HSPC-regulering, endotelceller og mesenkymale stamceller. Den fænotypiske analyse, der foreslås her, kan kombineres med musemutanter, sygdomsmodeller og funktionelle assays for at karakterisere HSPC-rummet og dets niche.
Introduction
Flowcytometri er en uvurderlig metode til at karakterisere og prospektivt isolere immun- og hæmatopoietiske celler. Det bruges også i stigende grad til at analysere stromale og epitelpopulationer af forskellige væv. Den hæmatopoietiske stamcelle (HSC) har unikke egenskaber ved selvfornyelse og multipotens. Hos voksne pattedyr befinder HSC’er sig primært i knoglemarven (BM), hvor de modtager hvile- og overlevelsessignaler fra det omgivende mikromiljø eller niche1. HSC’er defineres formelt i henhold til funktionelle assays2. Ikke desto mindre har flere skelsættende papirer vist nytten af flowcytometri til at identificere HSC’er. Gennem brug af begrænsede celleoverflademarkører er det muligt at skelne hæmatopoietiske populationer, der er højt beriget i HSC’er3. Flowcytometri er derfor en central metode i stamcellefeltet. Det er blevet brugt i vid udstrækning til at evaluere virkningen af formodede nichecelletyper og nichefaktorer på HSC’er. Ved at kombinere flowcytometri med billeddannelse og funktionelle assays har det vist sig, at HSC’er understøttes kritisk af perivaskulære mesenkymale stamceller (MSC’er) og endotelceller (EC’er). BM MSC’er er en heterogen gruppe og har forskellige cytokinbidrag4, men det er veletableret, at leptinreceptor (LepR) + MSC’er er nøglenicheceller1. BM EC’er er også meget heterogene og kan være en del af sinusoider, arterioler og type H / overgangsbeholdere5. Forskellige undersøgelser har vist disse forskellige EC’ers nuancerede bidrag. For eksempel er endosteale sinusformede EC’er rumligt tættere på hvilende HSC’er6, mens ikke-vandrende HSC’er med lavere niveauer af reaktive iltarter er placeret nær arteriolære EC’er7. Den endosteale versus centrale placering af nicher er også meget vigtig. Endosteal type H-kar er forbundet med perivaskulære stromale celler, der går tabt med aldring, hvilket fører til tab af HSC’er8. Ved akut myeloid leukæmi udvides centrale EC’er, mens endosteale kar og endosteale HSC’er går tabt9.
De fleste undersøgelser på området har fokuseret på selve hæmatopoiesen og på cellens ydre regulering af HSC’er. Det er imidlertid i stigende grad blevet anerkendt, at der er behov for bedre at karakterisere de nicher, der regulerer andre forfædre, nemlig multipotente forfædre (MPP’er), især i betragtning af at de er de vigtigste drivkræfter for hæmatopoiesis i steady state10. I modsætning til en fast hierarkisk struktur har nylige undersøgelser vist, at hæmatopoiesis er et kontinuum, hvor HSC’er differentierer sig til forudindtagede MPP’er på et tidligt stadium11. MPP’er er blevet opkaldt efter forskellige klassificeringsordninger12, men et nyligt konsensuspapir fra International Society for Experimental Hematology (ISEH) foreslog, at MPP’er skulle diskrimineres som tidlige MPP’er og i henhold til deres lymfoide (MPP-Ly), megakaryocytiske og erythroid (MPP-Mk / E) og myeloide (MPP-G / M) bias13. Brugen af flowcytometri vil være afgørende for yderligere at studere betydningen af BM-nicher i reguleringen af disse populationer. Nuværende flowcytometrimetoder bruger variable gating-strategier til at differentiere HSPC’er og identificere stromale celler, nemlig EC’er, ved hjælp af inkonsekvente markører. Målet med den nuværende metode er at præsentere en enkel og reproducerbar arbejdsgang for BM-farvning for at identificere HSPC-subpopulationer, heterogene grupper af EC’er og LepR + MSC’er. Vi mener, at denne teknik, selvom den er sammenlignelig med tidligere rapporterede metoder (se for eksempel reference 14), giver en opdateret og let at implementere protokol til fænotypisk analyse af hæmatopoietiske celler i de to funktionelle marvområder, endosteal og central BM 8,15 samt BM stromale nicheceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens den beskrevne protokol er enkel og nem at udføre, bør der lægges særlig vægt på specifikke trin. For eksempel, når der opnås skyllet BM (trin 5.2), bør volumen eller antal gange, der er angivet for at passere PBS 2% FBS gennem indersiden af den centrale del af knoglen, ikke overskrides, da dette kan resultere i signifikant kontaminering af den skyllede prøve med endosteale cellepopulationer.
Ændringer i protokollen kan foretages for at lette dens udførelse af efterforskeren. V…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LM blev støttet af et tilskud fra Lady Tata Memorial Trust. JR blev støttet af et ph.d.-stipendium fra Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT-stipendium UI/BD/150833/2021). ML blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD blev støttet af tilskud fra American Society of Hematology, Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) og Portuguese Society of Hematology. Vi takker støtten fra Dr. Catarina Meireles og Emilia Cardoso fra Tracy-anlægget på i3s.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
- Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
- Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
- Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
- Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
- Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
- Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).
