म्यूरिन अस्थि मज्जा हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं और स्ट्रोमल आला कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
Summary
यहां, हम सहायक आला एंडोथेलियल और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के साथ-साथ फेनोटाइप हेमोपोइटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं के लिए मुराइन अस्थि मज्जा कोशिकाओं के अलगाव और धुंधलापन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एंडोचोरी और केंद्रीय अस्थि मज्जा क्षेत्रों में स्थित कोशिकाओं को समृद्ध करने की एक विधि भी शामिल है।
Abstract
अस्थि मज्जा (बीएम) हड्डियों के भीतर पाया जाने वाला नरम ऊतक है जहां हेमटोपोइजिस, वह प्रक्रिया जिसके द्वारा नई रक्त कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं, मुख्य रूप से होती हैं। जैसे, इसमें हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) शामिल हैं, साथ ही सहायक स्ट्रोमल कोशिकाएं हैं जो एचएसपीसी के रखरखाव और विनियमन में योगदान करती हैं। यहां, हम फ्लो साइटोमेट्री द्वारा मुराइन बीएम एचएसपीसी और स्ट्रोमल आला आबादी के फेनोटाइपिक विश्लेषण के माध्यम से स्वास्थ्य और घातकता में हेमटोपोइजिस का अध्ययन करने की एक विधि का वर्णन करते हैं। हमारी विधि एंडोस्टोल और केंद्रीय बीएम अंशों में बीएम कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए आवश्यक कदमों का विवरण देती है, साथ ही एचएसपीसी विनियमन, एंडोथेलियल कोशिकाओं और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं में शामिल दो प्रमुख आला सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए उपयुक्त गेटिंग रणनीतियों का विवरण देती है। यहां प्रस्तावित फेनोटाइपिक विश्लेषण को एचएसपीसी डिब्बे और उसके आला को चिह्नित करने के लिए माउस उत्परिवर्ती, रोग मॉडल और कार्यात्मक परख के साथ जोड़ा जा सकता है।
Introduction
फ्लो साइटोमेट्री प्रतिरक्षा और हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को चिह्नित करने और भावी प्रभाव से अलग करने के लिए एक अमूल्य विधि है। यह विभिन्न ऊतकों के स्ट्रोमल और उपकला आबादी का विश्लेषण करने के लिए भी तेजी से उपयोग किया जा रहा है। हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) में आत्म-नवीकरण और बहुशक्ति के अद्वितीय गुण हैं। वयस्क स्तनधारियों में, एचएससी मुख्य रूप से अस्थि मज्जा (बीएम) में रहते हैं, जहां वे आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट या आला1 से जिज्ञासा और उत्तरजीविता संकेत प्राप्त करते हैं। एचएससी को औपचारिक रूप से कार्यात्मक परख2 के अनुसार परिभाषित किया गया है। फिर भी, कई ऐतिहासिक पत्रों ने एचएससी की पहचान करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री की उपयोगिता दिखाई है। सीमित सेल सतह मार्करों के उपयोग के माध्यम से, हेमटोपोइएटिक आबादी को भेदभाव करना संभव है जो एचएससी3 में अत्यधिक समृद्ध हैं। फ्लो साइटोमेट्री, इसलिए, स्टेम सेल क्षेत्र में एक केंद्रीय विधि है। एचएससी पर कथित आला सेल प्रकारों और आला कारकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इसका बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। इमेजिंग और कार्यात्मक परख के साथ फ्लो साइटोमेट्री के संयोजन से, यह दिखाया गया है कि एचएससी पेरिवास्कुलर मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) और एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) द्वारा गंभीर रूप से समर्थित हैं। बीएम एमएससी एक विषमसमूह हैं और इसमें अलग-अलग साइटोकिन योगदान4 हैं, लेकिन यह अच्छी तरह से स्थापित है कि लेप्टिन रिसेप्टर (एलईपीआर) + एमएससी प्रमुख आला कोशिकाएंहैं। बीएम ईसी भी अत्यधिक विषम हैं और साइनसोइड्स, धमनी और टाइप एच / संक्रमणकालीन वाहिकाओंका हिस्सा हो सकते हैं। विभिन्न अध्ययनों ने इन विभिन्न ईसी के सूक्ष्म योगदान को दिखाया है। उदाहरण के लिए, एंडोस्टेल साइनसॉइडल ईसी स्थानिक रूप से क्विसेंट एचएससी6 के करीब हैं, जबकि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के निम्न स्तर वाले गैर-प्रवासी एचएससी धमनी ईसीएस7 के पास स्थित हैं। एंडोचोरी बनाम आला का केंद्रीय स्थान भी बहुत महत्वपूर्ण है। एंडोस्टेल टाइप एच वाहिकाएं पेरिवास्कुलर स्ट्रोमल कोशिकाओं से जुड़ी होती हैं जो उम्र बढ़ने के साथ खो जाती हैं, जिससे एचएससी8 का नुकसान होता है। तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में, केंद्रीय ईसी का विस्तार किया जाता है, जबकि एंडोचोरी वाहिकाओं और एंडोचोरी एचएससीखो जाते हैं।
क्षेत्र में अधिकांश अध्ययनों ने हेमटोपोइजिस पर और एचएससी के सेल के बाह्य विनियमन पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, यह तेजी से मान्यता प्राप्त है कि अन्य पूर्वजों, अर्थात् मल्टीपोटेंट पूर्वजों (एमपीपी) को विनियमित करने वाले niches को बेहतर ढंग से चिह्नित करने की आवश्यकता है, विशेष रूप से यह देखते हुए कि वेस्थिर अवस्था में हेमटोपोइजिस के मुख्य चालक हैं। एक निश्चित पदानुक्रमित संरचना के विपरीत, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि हेमटोपोइजिस एक निरंतरता है जिसमें एचएससी प्रारंभिक चरण11 में पक्षपाती एमपीपी में अंतर करते हैं। एमपीपी का नाम विभिन्न वर्गीकरण योजनाओं के नाम पर रखा गया है, लेकिन इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्सपेरिमेंटल हेमेटोलॉजी (आईएसईएच) द्वारा हाल ही में एक आम सहमति पत्र में एमपीपी को प्रारंभिक एमपीपीके रूप में और उनके लिम्फोइड (एमपीपी-एलवाई), मेगाकैरियोसाइटिक और एरिथ्रोइड (एमपीपी-एमके / ई), और माइलॉयड (एमपीपी-जी / एम) पूर्वाग्रह13 के अनुसार भेदभाव करने का प्रस्ताव दिया गया है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग इन आबादी के नियमन में बीएम niches के महत्व का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण होगा। वर्तमान फ्लो साइटोमेट्री विधियां एचएसपीसी को अलग करने और असंगत मार्करों का उपयोग करके स्ट्रोमल कोशिकाओं, अर्थात् ईसी की पहचान करने के लिए परिवर्तनीय गेटिंग रणनीतियों का उपयोग करती हैं। वर्तमान विधि का लक्ष्य एचएसपीसी उप-आबादी, ईसी के विषम समूहों और एलईपीआर + एमएससी की पहचान करने के लिए बीएम स्टेनिंग का एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वर्कफ़्लो प्रस्तुत करना है। हमारा मानना है कि यह तकनीक, हालांकि पहले रिपोर्ट किए गए तरीकों के साथ तुलनीय है (देखें, उदाहरण के लिए, संदर्भ14), दो कार्यात्मक मज्जा क्षेत्रों, एंडोचोरी और केंद्रीय बीएम 8,15, साथ ही बीएम स्ट्रोमल आला कोशिकाओं में हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं के फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए एक अद्यतन और आसानी से लागू प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि वर्णित प्रोटोकॉल सरल और प्रदर्शन करने में आसान है, विशिष्ट चरणों पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, फ्लश ्ड बीएम (चरण 5.2) प्राप्त करते समय, हड्डी के मध्य भाग के अंदर से पीबीएस 2% एफबीएस को प?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एलएम को लेडी टाटा मेमोरियल ट्रस्ट से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। जेआर को फंडाको पैरा ए सिएन्सिया ई टेक्नोलोगिया (एफसीटी) से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; एफसीटी फैलोशिप यूआई/बीडी/150833/2021)। एमएल को एफसीटी (एफसीटी फैलोशिप 2021.04773.BD) से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। डीडी को अमेरिकन सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी, पाब्लोव फाउंडेशन, एफसीटी (एक्सपीएल / मेड-ओएनसी / 0522/2021), और पुर्तगाली सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम आई 3 एस में ट्रेसी सुविधा के डॉ कैटरीना मीरेल्स और एमिलिया कार्डोसो के समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
- Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
- Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
- Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
- Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
- Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
- Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
- Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
- Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).
