Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale
Summary
Qui, descriviamo un semplice protocollo per l’isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.
Abstract
Il midollo osseo (BM) è il tessuto molle trovato all’interno delle ossa dove si verifica principalmente l’ematopoiesi, il processo mediante il quale vengono generate nuove cellule del sangue. Come tale, contiene cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), oltre a sostenere le cellule stromali che contribuiscono al mantenimento e alla regolazione delle HSPC. I disturbi ematologici e altri disturbi del BM interrompono l’ematopoiesi colpendo direttamente le cellule ematopoietiche e/o attraverso l’alterazione della nicchia BM. Qui, descriviamo un metodo per studiare l’ematopoiesi in salute e malignità attraverso l’analisi fenotipica di BM HSPC murini e popolazioni di nicchia stromali mediante citometria a flusso. Il nostro metodo descrive in dettaglio i passaggi necessari per arricchire le cellule BM nelle frazioni BM endostali e centrali, nonché le strategie di gating appropriate per identificare i due tipi di cellule di nicchia chiave coinvolte nella regolazione HSPC, le cellule endoteliali e le cellule staminali mesenchimali. L’analisi fenotipica qui proposta può essere combinata con mutanti murini, modelli di malattia e saggi funzionali per caratterizzare il compartimento HSPC e la sua nicchia.
Introduction
La citometria a flusso è un metodo inestimabile per caratterizzare e isolare prospetticamente le cellule immunitarie ed ematopoietiche. Viene anche sempre più utilizzato per analizzare popolazioni stromali ed epiteliali di diversi tessuti. La cellula staminale ematopoietica (HSC) ha proprietà uniche di auto-rinnovamento e multipotenza. Nei mammiferi adulti, le HSC risiedono principalmente nel midollo osseo (BM), dove ricevono segnali di quiescenza e sopravvivenza dal microambiente circostante o dalla nicchia1. Le HSC sono formalmente definite secondo i saggi funzionali2. Tuttavia, diversi documenti di riferimento hanno dimostrato l’utilità della citometria a flusso per identificare le HSC. Attraverso l’uso di marcatori di superficie cellulare limitati, è possibile discriminare popolazioni ematopoietiche che sono altamente arricchite in HSCs3. La citometria a flusso è, quindi, un metodo centrale nel campo delle cellule staminali. È stato ampiamente utilizzato per valutare l’impatto di tipi di cellule di nicchia putativi e fattori di nicchia sulle HSC. Combinando la citometria a flusso con l’imaging e i saggi funzionali, è stato dimostrato che le HSC sono supportate criticamente dalle cellule staminali mesenchimali perivascolari (MSC) e dalle cellule endoteliali (ECs). Le MSC BM sono un gruppo eterogeneo e hanno diversi contributi di citochine4, ma è ben noto che le MSC del recettore della leptina (LepR)+ sono cellule di nicchia chiave1. Le EC BM sono anche altamente eterogenee e possono far parte di sinusoidi, arteriole e vasi transizionali di tipo H/ 5. Diversi studi hanno dimostrato il contributo sfumato di queste diverse CE. Ad esempio, le EC sinusoidali endostre sono spazialmente più vicine alle HSC quiescenti6, mentre le HSC non migratorie con livelli più bassi di specie reattive dell’ossigeno si trovano vicino alle EC arteriolari7. Anche la posizione endostale rispetto alla posizione centrale delle nicchie è molto importante. I vasi endostali di tipo H sono associati alle cellule stromali perivascolari che vengono perse con l’invecchiamento, portando alla perdita di HSC8. Nella leucemia mieloide acuta, le EC centrali sono espanse, mentre i vasi endostali e le HSC endostali vengono persi9.
La maggior parte degli studi sul campo si sono concentrati sull’ematopoiesi stessa e sulla regolazione estrinseca delle HSC da parte della cellula. È stato, tuttavia, sempre più riconosciuto che vi è la necessità di caratterizzare meglio le nicchie che regolano altri progenitori, vale a dire i progenitori multipotenti (MPP), in particolare considerando che sono i principali driver dell’ematopoiesi allo stato stazionario10. In contrasto con una struttura gerarchica fissa, studi recenti hanno dimostrato che l’ematopoiesi è un continuum in cui le HSC si differenziano in MPP distorte in una fase iniziale11. Le MPP sono state nominate in base a diversi schemi di classificazione12, ma un recente documento di consenso della Società internazionale per l’ematologia sperimentale (ISEH) ha proposto che le MPP fossero discriminate come MPP precoci e in base alla loro distorsione linfoide (MPP-Ly), megacariocitica ed eritroide (MPP-Mk / E) e mieloide (MPP-G / M)13. L’uso della citometria a flusso sarà fondamentale per studiare ulteriormente l’importanza delle nicchie BM nella regolazione di queste popolazioni. Gli attuali metodi di citometria a flusso utilizzano strategie di gating variabili per differenziare le HSPC e identificare le cellule stromali, vale a dire le EC, utilizzando marcatori incoerenti. L’obiettivo del metodo attuale è quello di presentare un flusso di lavoro semplice e riproducibile di colorazione BM per identificare sottopopolazioni HSPC, gruppi eterogenei di EC e MSC LepR +. Riteniamo che questa tecnica, sebbene comparabile con i metodi precedentemente riportati (vedi, ad esempio, riferimento 14), fornisca un protocollo aggiornato e facile da implementare per l’analisi fenotipica delle cellule ematopoietiche nelle due aree funzionali del midollo, endostale e BM centrale 8,15, nonché delle cellule di nicchia stromale BM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre il protocollo descritto è semplice e facile da eseguire, è necessario prestare particolare attenzione a passaggi specifici. Ad esempio, quando si ottiene BM lavato (fase 5.2), il volume o il numero di volte indicato per passare PBS 2% FBS attraverso l’interno della parte centrale dell’osso non deve essere superato, in quanto ciò potrebbe comportare una contaminazione significativa del campione lavato da popolazioni di cellule endosteali.
È possibile apportare modifiche al protocollo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LM è stato sostenuto da una sovvenzione del Lady Tata Memorial Trust. JR è stato supportato da una borsa di dottorato della Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT fellowship UI/BD/150833/2021). ML è stato supportato da una borsa di dottorato di dottorato da FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). La DD è stata sostenuta da sovvenzioni dell’American Society of Hematology, della Pablove Foundation, della FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) e della Società portoghese di ematologia. Ringraziamo il supporto della Dott.ssa Catarina Meireles ed Emilia Cardoso della struttura TRACY di i3s.
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
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