Polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor eukaryote polysoomzuivering van intacte sojabonenknobbels. Na sequencing kunnen standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te identificeren.
Abstract
Het doel van dit protocol is om een strategie te bieden voor het bestuderen van het eukaryote translatoom van de symbiotische knobbel van sojabonen (Glycine max). Dit artikel beschrijft methoden die zijn geoptimaliseerd om van planten afgeleide polyribosomen en de bijbehorende mRNA’s te isoleren die moeten worden geanalyseerd met behulp van RNA-sequencing. Ten eerste worden cytoplasmatische lysaten verkregen door homogenisatie in polysomische en RNA-conserverende omstandigheden van hele, bevroren sojabonenknobbels. Vervolgens worden lysaten gewist door centrifugatie met lage snelheid en wordt 15% van het supernatant gebruikt voor totale RNA (TOTAL) isolatie. Het resterende geklaarde lysaat wordt gebruikt om polysomen te isoleren door ultracentrifugatie door een tweelaags sucrosekussen (12% en 33,5%). Polysoom-geassocieerd mRNA (PAR) wordt gezuiverd uit polysomale pellets na resuspensie. Zowel TOTAL als PAR worden geëvalueerd door zeer gevoelige capillaire elektroforese om te voldoen aan de kwaliteitsnormen van sequencingbibliotheken voor RNA-seq. Als voorbeeld van een downstream-toepassing kunnen na sequencing standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te verkrijgen. Samenvattend maakt deze methode, in combinatie met RNA-seq, de studie mogelijk van de translationele regulatie van eukaryote mRNA’s in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel.
Introduction
Vlinderbloemige planten, zoals sojabonen (Glycine max), kunnen symbiose tot stand brengen met specifieke bodembacteriën die rhizobia worden genoemd. Deze mutualistische relatie lokt de vorming uit van nieuwe organen, de symbiotische knobbeltjes, op de plantenwortels. De knobbeltjes zijn de plantenorganen die de bacteriën herbergen en bestaan uit gastheercellen waarvan het cytoplasma wordt gekoloniseerd met een gespecialiseerde vorm van rhizobia die bacteroïden wordt genoemd. Deze bacteroïden katalyseren de reductie van atmosferische stikstof (N2) tot ammoniak, die wordt overgebracht naar de plant in ruil voor koolhydraten 1,2.
Hoewel deze stikstofbindende symbiose een van de meest bestudeerde plant-microbe symbioses is, moeten veel aspecten nog beter worden begrepen, zoals hoe planten die worden blootgesteld aan verschillende abiotische stressomstandigheden hun interactie met hun symbiotische partner moduleren en hoe dit het knobbelmetabolisme beïnvloedt. Deze processen kunnen beter worden begrepen door het nodule-translatoom te analyseren (d.w.z. de subset van messenger RNA’s [mRNA’s] actief vertaald). Polyribosomen of polysomen zijn complexen van meerdere ribosomen geassocieerd met mRNA, vaak gebruikt om translatie te bestuderen3. De polysoomprofileringsmethode bestaat uit de analyse van de mRNA’s geassocieerd met polysomen en is met succes gebruikt om de posttranscriptionele mechanismen te bestuderen die genexpressie beheersen die voorkomt in diverse biologische processen 4,5.
Historisch gezien heeft de analyse van genoomexpressie zich voornamelijk gericht op het bepalen van mRNA-abundantie 6,7,8,9. Er is echter een gebrek aan correlatie tussen transcriptie- en eiwitniveaus als gevolg van de verschillende stadia van posttranscriptionele regulatie van genexpressie, met name translatie 10,11,12. Bovendien is er geen afhankelijkheid waargenomen tussen de veranderingen op het niveau van het transcriptoom en die op het niveau van het translatoom13. De directe analyse van de set mRNA’s die worden vertaald, maakt een nauwkeurigere en volledigere meting van de celgenexpressie mogelijk (waarvan het eindpunt eiwitrijkdom is) dan degene die wordt verkregen wanneer alleen mRNA-niveaus worden geanalyseerd 14,15,16.
Dit protocol beschrijft hoe plantaardige polysomen worden gezuiverd uit intacte sojaknollen door differentiële centrifugatie door een tweelaags sucrosekussen (figuur 1). Omdat van bacteroïden afgeleide ribosomen echter ook in de knobbeltjes aanwezig zijn, wordt een mix van ribosomen en RNA-soorten gezuiverd, ook al vertegenwoordigen de eukaryote de belangrijkste fractie (90% -95%). De daaropvolgende RNA-isolatie, kwantificering en kwaliteitscontrole worden ook beschreven (figuur 1). Dit protocol, in combinatie met RNA-seq, moet experimentele resultaten opleveren over de translationele regulatie van eukaryote mRNA’s in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de voorgestelde methodologie voor eukaryote polysoomzuivering uit symbiotische knobbeltjes. Het schema geeft een overzicht van de stappen die in het protocol worden gevolgd van (1) plantengroei en (2) nodule-oogst tot (3) bereiding van de cytosolische extracten, (3) het verkrijgen van TOTAL-monsters en (4) PAR-monsters, en (5) RNA-extractie en kwaliteitscontrole. Afkortingen: PEB = polysoom extractiebuffer; RB = resuspensiebuffer; TOTAAL = totaal RNA; PAR = polysoom-geassocieerd mRNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bestuderen van genexpressieregulatie op translationeel niveau is van cruciaal belang om verschillende biologische processen beter te begrijpen, aangezien het eindpunt van celgenexpressie eiwitrijkdom is13,14. Dit kan worden beoordeeld door het translatoom te analyseren van het weefsel of organisme van belang waarvoor de polysomale fractie moet worden gezuiverd en de bijbehorende mRNA’s moet worden geanalyseerd 3,4,34,35,36.<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door CSIC I+D 2020 subsidie nr. 282, FVF 2017 subsidie nr. 210 en PEDECIBA (María Martha Sainz).
Materials
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans. Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- . Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer’s disease model mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
