Drosophila melanogaster 유충 지방체에서 기아로 인한 자가포식 분석
Summary
현재 프로토콜은 영양소 고갈을 통한 초파리 멜라노가스터 유충 지방체에서 자가포식 유도를 설명하고 형질전환 파리 균주를 사용하여 자가포식의 변화를 분석합니다.
Abstract
자가포식은 세포 자가 소화 과정입니다. 그것은 기아를 포함한 다양한 스트레스에 대한 반응으로 분해를 위해 리소좀에 화물을 전달합니다. 자가포식의 오작동은 노화 및 여러 인간 질병과 관련이 있습니다. 자가포식 기계는 효모에서 인간에 이르기까지 고도로 보존되어 있습니다. 척추동물의 간 및 지방 조직의 유사체인 Drosophila melanogaster의 유충 지방체는 생체 내에서 자가포식을 모니터링하기 위한 고유한 모델을 제공합니다. 자가포식은 애벌레 지방체의 영양소 결핍에 의해 쉽게 유도될 수 있습니다. 대부분의 자가포식 관련 유전자는 초파리 에서 보존됩니다. 태그가 부착된 자가포식 마커를 발현하는 많은 형질전환 파리 균주가 개발되었으며, 이는 자가포식 과정의 여러 단계를 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 클론 분석을 통해 동일한 조직에서 서로 다른 유전자형을 가진 세포의 자가포식 마커를 면밀히 비교할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 (1) 유충 지방체에서 체세포 클론 생성, (2) 아미노산 기아를 통한 자가포식 유도, (3) 유충 지방체 해부, 자가포식소체 마커(GFP-Atg8a) 및 클론 분석을 사용하여 자가포식의 차이를 분석하는 모델을 만드는 것을 목표로 합니다.
Introduction
자가포식(Autophagy)은 아미노산 결핍을 포함한 다양한 스트레스에 의해 유발되는 “자가 섭식” 과정이다1. 거대자가포식(Macroautophagy, 이하 자가포식)은 가장 잘 연구된 자가포식 유형으로, 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다2. 자가포식의 오작동은 여러 인간 질병과 관련이 있습니다3. 또한, 일부 자가포식 관련 유전자는 다양한 질병을 치료하기 위한 잠재적 표적이다4.
자가포식은 매우 정교한 방식으로 조절됩니다5. 굶주림이 발생하면, 격리막은 세포질 물질을 격리하여 이중막의 자가포식소체를 형성한다6. 그런 다음 자가포식소체는 엔도솜 및 리소좀과 융합하여 양서류 및 자가이소좀을 형성합니다. 리소좀 가수분해 효소의 도움으로 삼켜진 세포질 내용물이 분해되고 영양소가 재활용된다7.
자가포식(Autophagy)은 진화적으로 보존된 과정이다8. Drosophila melanogaster는 생체 내에서 자가포식 과정을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 아미노산 결핍은 인간의 간과 지방 조직의 유사체인 파리 지방 신체 조직에서 자가포식을 쉽게 유도한다9. 자가포식의 결함은 Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 및 p62와 같은 여러 자가포식 관련 단백질의 뚜렷한 점자 패턴을 방해합니다10. 따라서 이러한 자가포식 마커의 패턴을 분석하면 자가포식 결함의 발생과 결함 있는 자가포식 단계를 식별하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어, 유비퀴틴 유사 단백질 Atg8은 가장 일반적으로 사용되는 자가포식 마커(11)이다. 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서는 녹색 형광 단백질(GFP) 태그가 붙은 Atg8a를 가진 형질전환 균주가 성공적으로 개발되었다12. GFP-Atg8a는 공급된 세포의 세포질과 핵에서 확산됩니다. 굶주림시, GFP-Atg8a는 포스파티딜 에탄올 아민 (PE)에 의해 처리되고 변형되어 단열막과 완전히 발달 된 자가 포식 소체13,14를 표시하는 puncta를 형성합니다. 직접 형광 현미경을 통해, 자가포식 유도는 GFP-Atg8 점자 형성의 증가로 쉽게 관찰될 수 있다15. Atg8a 반점은 자가포식 개시 결함이 있는 경우 기아에 대한 반응으로 형성되지 않습니다. GFP-Atg8a는 자가분해체의 낮은 pH에 의해 소멸 및 소화될 수 있기 때문에, 자가포식이 후기 단계에서 차단되면 GFP-Atg8a 반점의 수가 증가할 수 있다16.
자가포식은 영양 가용성에 매우 민감하기 때문에17, 배양 조건의 약간의 차이는 종종 표현형의 변화로 이어진다. 그러므로, 동일한 조직에서 돌연변이 세포와 야생형 대조군 세포를 분석하는 방법인 클론 분석은 자가포식 결함을 해부하는 데 큰 이점이 있다18. 상동 염색체 사이의 플립파스/플립파제 인식 표적(FLP/FRT) 매개 부위 특이적 재조합을 이용하여, 모자이크 조직을 운반하는 파리는 쉽게 만들어진다19,20. 돌연변이 세포를 둘러싼 야생형 세포는 개인차를 피하기 위해 완벽한 내부 조절을 형성한다21.
본 연구는 아미노산 결핍에 의한 자가포식을 유도하고 GFP-Atg8a를 발현하는 모자이크 지방 신체 조직을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 돌연변이 클론 간의 자가포식 차이를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 (1) 유충 지방체에서 돌연변이 클론을 운반하는 파리를 생성하고, (2) 아미노산 기아를 통해 자가포식을 유도하고, (3) 유충 지방체를 해부하는 방법을 설명합니다. 애벌레 지방체에서 클론을 성공적으로 생성하려면 다음과 같은 중요한 단계를 부지런히 수행해야 합니다. (1) 유사분열 재조합은 조직이 유사분열을 겪고 있을 때만 발생하기 때문에 열충격의 정확한 타이밍이 중요하고,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
파리 균주를 제공한 THFC와 BDSC에 감사드립니다. Tong Chao 박사는 중국 국립 자연 과학 재단 (32030027, 91754103, 92157201)과 중앙 대학을위한 기초 연구 기금의 지원을 받고 있습니다. 서비스를 제공해 주신 생명과학연구소(LSI)의 핵심 시설에 감사드립니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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