Un protocolo modificado de trasplante de corazón heterotópico murino que coincide con los estándares contemporáneos de técnica aséptica, anestesia y analgesia
Summary
El presente trabajo describe una técnica modificada para el trasplante cardíaco vascularizado heterotópico con técnica aséptica actualizada, analgesia y anestesia.
Abstract
El desarrollo de modelos experimentales de trasplante cardíaco en animales ha contribuido a muchos avances en los campos de la inmunología y el trasplante de órganos sólidos. Si bien el modelo heterotópico de trasplante cardíaco murino vascularizado se utilizó inicialmente en estudios de rechazo de injertos utilizando combinaciones de cepas de ratones endogámicos no coincidentes, el acceso a cepas modificadas genéticamente y modalidades terapéuticas puede proporcionar nuevos y poderosos conocimientos preclínicos. Fundamentalmente, la metodología quirúrgica para esta técnica no ha cambiado desde su desarrollo, especialmente con respecto a factores importantes como la técnica aséptica, la anestesia y la analgesia, que tienen impactos materiales en la morbilidad y mortalidad postquirúrgica. Además, se espera que las mejoras en el manejo perioperatorio proporcionen mejoras tanto en el bienestar animal como en los resultados experimentales. Este artículo informa sobre un protocolo desarrollado en colaboración con un experto en anestesia veterinaria y describe la técnica quirúrgica con énfasis en el manejo perioperatorio. Además, discutimos las implicaciones de estos refinamientos y proporcionamos detalles sobre la solución de problemas de pasos quirúrgicos críticos para este procedimiento.
Introduction
Debemos gran parte de nuestra comprensión de la inmunología y el trasplante a la investigación basada en modelos experimentales de trasplante de órganos sólidos utilizando sujetos animales. Desde la primera descripción del trasplante cardíaco vascularizado en mamíferos1, tales modelos han contribuido al conocimiento en amplios dominios, incluyendo la aplicación terapéutica de la hipotermia2, los beneficios del uso de suturas especializadas3 y técnicas para homotrasplantes totales de pulmón y corazón4. El desarrollo de modelos de trasplante cardíaco en ratas 5,6 proporcionó un alcance más amplio para la experimentación inmunológica debido a la disponibilidad de diferentes líneas de reproducción. La gama sustancialmente más amplia de cepas de ratones endogámicos y mutantes disponibles llevó a Corry et al.7 a desarrollar una técnica de trasplante cardíaco heterotópico murino debido a las considerables ventajas que este rango aporta a la investigación del trasplante. Este modelo ha sido ampliamente utilizado y ha contribuido para una mayor comprensión del rechazo del injerto8 y de la terapéutica9. Desde su primera descripción, sin embargo, la técnica se ha mantenido prácticamente sin cambios, aparte de algunos detalles técnicos menores, como los ajustes en la posición de los sitios anastomóticos10,11.
Desde la integración de la técnica de Corry et al.7 en nuestros experimentos, hemos identificado áreas prometedoras para mejorar el protocolo, a saber, las de la técnica aséptica, la anestesia y la analgesia. Se esperaba que las mejoras en estas áreas ofrecieran un impacto positivo en los resultados experimentales y mejoraran el bienestar animal. Esto ha sido demostrado previamente cuando la técnica aséptica es utilizada en cirugías de animales pequeños, ya que ayuda en la reducción de infecciones postoperatorias12, lo que no sólo afecta la morbilidad y la mortalidad, sino que también puede comprometer los experimentos diseñados para evaluar la respuesta inmune después de la cirugía de trasplante. Desde un punto de vista anestesia y analgésico, el uso de un régimen refinado ayuda a reducir el costo para los animales y equilibrar el argumento ético de este modelo quirúrgico al mitigar el dolor y el sufrimiento de los sujetos experimentales. Además, la anestesia y la analgesia adecuadas limitan la respuesta al estrés asociado al dolor, mejorando la calidad de la recuperación postoperatoria y, en última instancia, aumentando la tasa de éxito quirúrgico13.
Con el objetivo de mejorar tanto el bienestar animal como los resultados experimentales, se desarrolló un protocolo con ajustes para cerrar estas brechas. Este protocolo ha sido adaptado del descrito originalmente por Corry et al.7 con la consulta de un anestesista veterinario y teniendo debidamente en cuenta tanto los efectos como la duración de los efectos de las intervenciones farmacológicas utilizadas en el régimen anestésico y analgésico. El abordaje se basó en los principios de anestesia balanceada y analgesia multimodal para asegurar una adecuada atención perioperatoria14. Además de la aplicación de la técnica aséptica, el opioide buprenorfina y el anestésico local bupivacaína se administraron de forma preventiva. La anestesia general se realizó utilizando el agente anestésico inhalante isoflurano.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de trasplante cardíaco ortotópico murino es un modelo preclínico robusto utilizado principalmente para investigar los efectos del desajuste del MHC sobre el nivel y la naturaleza del rechazo inmunológico y, más recientemente, el efecto del trasplante sobre la retención de la inmunidad residente en el tejido del injerto16. Aunque inicialmente seguimos de cerca el protocolo de Corry et al.7 , hemos refinado el protocolo para incorporar estándares de mejores p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer los excelentes esfuerzos del personal de cuidado de animales de la Universidad de Australia Occidental y del Instituto Harry Perkins de Investigación Médica, cuya dedicación y experiencia contribuyeron a la viabilidad y el éxito de estas cirugías.
Materials
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved – 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator – 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight – 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp – 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape – 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors – curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture – 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle – 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe – 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe – 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | 0 | |
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 | 0 |
References
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M. Transplantation of the intact mammalian heart. Archives of Surgery. 26 (2), 219-224 (1933).
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F. Complete homologous heart transplantation. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (2), 174-178 (1953).
- Downie, H. G. Homotransplantation of the dog heart. A.M.A. Archives of Surgery. 66 (5), 624-636 (1953).
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Current Protocols in Immunology. 82, 1-14 (2008).
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).
