En modifisert murine heterotopisk hjertetransplantasjonsprotokoll som samsvarer med moderne standarder for aseptisk teknikk, anestesi og analgesi

Summary

Denne artikkelen beskriver en modifisert teknikk for heterotopisk vaskularisert hjertetransplantasjon med oppdatert aseptisk teknikk, analgesi og anestesi.

Abstract

Utviklingen av eksperimentelle modeller for hjertetransplantasjon hos dyr har bidratt til mange fremskritt innen immunologi og solid organtransplantasjon. Mens den heterotopiske murine hjertetransplantasjonsmodellen opprinnelig ble brukt i studier av transplantatavstøtning ved bruk av kombinasjoner av feilmatchede innavlede musestammer, kan tilgang til genetisk modifiserte stammer og terapeutiske modaliteter gi kraftig ny preklinisk innsikt. I utgangspunktet har den kirurgiske metodikken for denne teknikken ikke endret seg siden utviklingen, spesielt med hensyn til viktige faktorer som aseptisk teknikk, anestesi og analgesi, som har materiell innvirkning på postkirurgisk sykelighet og dødelighet. I tillegg forventes forbedringer i perioperativ ledelse å gi forbedringer i både dyrevelferd og eksperimentelle resultater. Denne artikkelen rapporterer om en protokoll utviklet i samarbeid med en fagekspert i veterinær anestesi og beskriver kirurgisk teknikk med vekt på perioperativ ledelse. I tillegg diskuterer vi implikasjonene av disse forbedringene og gir detaljer om feilsøking av kritiske kirurgiske trinn for denne prosedyren.

Introduction

Vi skylder mye av vår forståelse av immunologi og transplantasjon til forskning basert på eksperimentelle modeller av solid organtransplantasjon ved hjelp av dyreforsøkspersoner. Siden den første beskrivelsen av vaskularisert hjertetransplantasjon hos pattedyr¹ har slike modeller bidratt til kunnskap på vidtfavnende områder, inkludert terapeutisk anvendelse av hypotermi², fordelene ved å bruke spesialiserte suturer³ og teknikker for total lunge- og hjertehomotransplantasjon⁴. Utviklingen av hjertetransplantasjonsmodeller hos rotter ^5,6 ga bredere rom for immunologiske eksperimenter på grunn av tilgjengeligheten av forskjellige avlslinjer. Det betydelig bredere spekteret av tilgjengelige innavlede og mutante musestammer førte Corry et ^al.7 til å utvikle en teknikk for murine heterotopisk hjertetransplantasjon på grunn av de betydelige fordelene som dette området bringer til transplantasjonsforskning. Denne modellen har vært mye brukt og har bidratt til økt forståelse av transplantatavstøtning⁸ og terapeutikk⁹. Siden den første beskrivelsen har imidlertid teknikken stort sett vært uendret, bortsett fra noen mindre tekniske detaljer som justeringer av posisjonen til anastomotiske steder^10,11.

Siden integreringen av teknikken til Corry et ^al.7 i våre eksperimenter, har vi identifisert løfteområder for å forbedre protokollen, nemlig aseptisk teknikk, anestesi og analgesi. Forbedringer på disse områdene ble forventet å gi en positiv innvirkning på eksperimentelle resultater og forbedre dyrevelferden. Dette har tidligere blitt vist når aseptisk teknikk brukes i smådyroperasjoner, da det hjelper til med reduksjon av postoperative infeksjoner¹², som ikke bare påvirker sykelighet og dødelighet, men kan også kompromittere eksperimenter designet for å vurdere immunresponsen etter transplantasjonskirurgi. Fra et anestesi og smertestillende synspunkt bidrar bruken av et raffinert diett til å redusere kostnadene for dyr og balansere det etiske argumentet til denne kirurgiske modellen ved å redusere smerten og lidelsen til eksperimentelle. Videre begrenser passende anestesi og analgesi den smerteassosierte stressresponsen, forbedrer kvaliteten på postoperativ utvinning og til slutt øker den kirurgiske suksessraten¹³.

Med sikte på å forbedre både dyrevelferd og eksperimentelle resultater, ble det utviklet en protokoll med justeringer for å bygge bro over disse gapene. Denne protokollen er tilpasset fra det som opprinnelig ble beskrevet av Corry et ^al.7 med konsultasjon fra en veterinæranestesilege og med behørig hensyn til både effektene og varigheten av effektene av de farmakologiske inngrepene som brukes i anestesi- og smertestillende behandling. Tilnærmingen var basert på prinsippene om balansert anestesi og multimodal analgesi for å sikre forsvarlig perioperativ behandling¹⁴. I tillegg til aseptisk teknikk ble opioidet buprenorfin og lokalanestetikumet bupivakain gitt på forhånd. Narkose ble utført ved bruk av inhalasjonsanestesimiddelet isofluran.

Protocol

Denne forskningen ble utført i samsvar med Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purpose15 og godkjent under Animal Ethics Protocols RA/3/100/1568 og AE173 (The University of Western Australia Animal Ethics Committee og The Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee, henholdsvis). Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og dyr som brukes i denne protokollen. 1. Forbe…

Representative Results

For å bestemme effektiviteten av den kirurgiske teknikken for å fremme gode resultater av sårheling og musegjenoppretting, bestemte tidlige eksperimenter i laboratoriet overlevelsesegenskapene til en rekke hjertetransplantater av variabel immunogenitet til mottakeren. Disse inkluderte kongene (n = 5) og syngene (n = 5) transplantater, som deler de samme store histokompatibilitetskompleksmarkørene (MHC) som mottakeren, og store mismatch-transplantater (n = 9), der transplantatet og mottakeren har forskjellige MHC-mark…

Discussion

Murine ortotopisk hjertetransplantasjonsmodell er en robust preklinisk modell som primært brukes til å undersøke effekten av MHC-mismatch på nivået og arten av immunologisk avstøtning og, mer nylig, effekten av transplantasjon på retensjon av transplantatvevsresident immunitet¹⁶. Mens vi i utgangspunktet fulgte Corry et ^{al.7-protokollen} , har vi raffinert protokollen for å innlemme beste praksisstandarder for aseptisk teknikk, analgesi og anestesi. Oppdateringen av …

Materials

2030 Rycroft irrigating cannula 30 G	McFarlane	56005HU
Braided surgical silk 7-0
Bulldog clamp curved – 35 mm	Roboz	RS-7441-5
Bupivacaine 0.25%
Buprenorphine
Castroviejo needle holder catch curved -  145 mm	Haag-Streit	11.62.15
Chlorhexidine 5% solution	Ebos	JJ61371
Cotton-tipped applicator – 7.5 cm	Dove	SN109510
Ethanol 70% solution	Ebos	WH130192EE
Gauze 5 x 5 cm white	Aero	AGS50
Gelfoam 80 mm x 125 mm	Pfizer	7481D
Hair clipper	Wahl	9860L
Heparin 1,000 IU in 1 mL
Iris SuperCut scissors straight – 11.5 cm	Inka Surgical	11550.11
Isoflurane vaporiser	Darvall	9176
Micro bulldog clamp – 3.7 cm	Greman	14119-G
Micro scissors curved 105 mm
Micropore plain paper surgical tape – 2.5 cm wide	Ebos	7810L
Microsurgical scissors – curved tip
Monofilament polyprolene suture – 5/0	Surgipro	P-205-X
Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g	Myweigh	Kit00053
Needle – 30 G x 0.5 inch	BD	BD304000
Needleholder 15 cm curved "super fine"	Surgical Specialists	ST-B-15-8.2
Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300
Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm	B. Braun	FD281R
Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm	B. Braun	FD280R
Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm		15400-12
Spring scissors-Cvd Sm blades		15001-08
Stevens scissors blunt straight 110 mm
Surgical backboard			Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm
Surgical drapes			Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm
Surgical microscope
Syringe – 1 mL	BD	592696
Syringe – 3 mL	Leica	M651
Toothed forceps	BD	309657
University of Wisconsin Solution
Warming pad			Far infrared warming pad 20 x 25 cm
Westcott spring scissors
Yasargil clip applier bayonet	Aesculap	FE582K
Yasargil titanium clip perm 6.6 mm	Aesculap	A19FT222T
Mouse usage
Strain/SEX/Weight	Donor	Recipent
BALB/c, female, 19-23 g	7	21
C57BL/6, female, 17-20 g	7	0
CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g	5	0