Получение некардиомиоцитарной клеточной суспензии для секвенирования одноклеточной РНК из сердца взрослой мыши после инфаркта миокарда
Summary
Здесь мы описываем протокол для выделения достаточного количества единичных некардиомиоцитов с высокой жизнеспособностью из сердца мыши после инфаркта миокарда (ИМ). Это может быть использовано для последующего секвенирования отдельных клеток, анализа проточной цитометрии и первичной клеточной культуры.
Abstract
Инфаркт миокарда (ИМ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний с ростом смертности во всем мире. Некардиомиоциты составляют более половины всей популяции сердечных клеток, и они способствуют адаптивной компенсации при повреждении миокарда, включая воспалительные реакции, восстановление тканей и образование рубцов. Для изучения микроокружения сердца после инфаркта миокарда широко используется секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) для идентификации различных типов сердечных клеток и межклеточных коммуникаций. Среди процедур подготовки образца scRNA-seq приготовление клеточной суспензии является одним из наиболее важных этапов, поскольку жизнеспособность клеток может повлиять на качество результатов scRNA-seq. Поэтому мы разработали экспериментальный протокол для получения суспензии некардиомиоцитарных клеток из сердец мышей после инфаркта миокарда с дополнительным акцентом на улучшение жизнеспособности клеток путем выбора мягких пищеварительных ферментов, контроля времени пищеварения и применения флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Наконец, мы выделили CD45+ клетки из суспензии некардиомиоцитарных клеток, полученной по этому протоколу, а затем провели секвенирование скРНК.
Introduction
Инфаркт миокарда (ИМ) является одним из наиболее распространенных сердечно-сосудистых заболеваний, и смертность от него растет во всеммире1. Инфаркт миокарда вызван недостаточным кровоснабжением окружающего миокарда, что может быть результатом закупорки коронарной артерии, возникающей при разрыве атеросклеротической бляшки. Хотя чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) снизило показатели смертности пациентов с острым инфарктом миокарда, высокая распространенность сердечной недостаточности после инфаркта миокарда остается проблемой2. Ключевой патофизиологией, лежащей в основе сердечной недостаточности после инфаркта миокарда, является компенсаторная реакция организма на сердечные повреждения, которая включает замену мертвой сердечной мышцы несократительными фиброзными рубцами. Эти адаптивные реакции в значительной степени зависят от местного воспаления, опосредованного взаимодействиями между несколькими типами клеток и клетками сердечной ткани, и это воспаление в настоящее время рассматривается как потенциальная терапевтическая мишень для уменьшения образования фиброзных рубцов и, таким образом, защиты от сердечной недостаточности после инфарктамиокарда 3,4. Интересно, что микроокружение в месте инфаркта испытывает зависящий от времени переход в инфильтрационных типах клеток и функционирует на разных стадиях ИМ 1,5. Многие исследования показали, что некардиомиоциты (например, иммунные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки) играют центральную роль в воспалении после инфаркта миокарда и восстановлении тканей 5,6. В последние годы секвенирование отдельных клеток широко используется в качестве мощного инструмента для выяснения вовлеченности и функций некардиомиоцитов в микросреде после инфарктамиокарда 7,8. Это дает представление о патофизиологии травмы и восстановления после инфаркта миокарда, а также о разработке потенциальных методов лечения сердечной недостаточности после инфаркта миокарда.
Высокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-Seq) — это метод, используемый для подробного изучения целых транскриптомов с использованием секвенирования следующего поколения (NGS)7,8,9. В последнее время разработка scRNA-Seq произвела революцию в области биомедицинских исследований. По сравнению с обычным массовым секвенированием, scRNA-Seq анализирует профили экспрессии генов и гетерогенность транскрипции на уровне отдельных клеток 7,8. Этот метод значительно способствует исследованию клеточной патофизиологии ИМ 9,10 путем идентификации различных типов циркулирующих клеток в микроокружении после ИМ и выявления взаимодействия между кардиомиоцитами и некардиомиоцитами. Эти результаты также способствуют выявлению новых терапевтических целей для сердечной недостаточности после инфаркта миокарда. В целом, эксперимент после инфаркта миокарда на основе scRNA-seq включает три основных раздела: (1) создание модели животных после инфаркта миокарда; (2) приготовление клеточной суспензии; и (3) секвенирование образцов и анализ данных. Примечательно, что приготовление клеточной суспензии является наиболее важным этапом подготовки эксперимента scRNA-Seq, поскольку качество клеточной суспензии определяет точность результатов.
Этот протокол предназначен для извлечения суспензии некардиомиоцитарных клеток из сердечной ткани после инфаркта миокарда; Важно отметить, что включены конкретные детали для поддержания жизнеспособности и разрешения клеток. Между тем, оборудование, используемое в этом протоколе, такое как хирургические наборы для мышей, аппараты искусственной вентиляции легких грызунов и центрифуги, можно найти в большинстве экспериментальных центров на животных и биомедицинских лабораторий, и, таким образом, стоимость эксперимента по этому протоколу относительно низкая. Кроме того, если рассматривать временные моменты и места инфаркта в качестве переменных, этот протокол может быть применен для моделирования широкого спектра клинических сценариев, особенно для осложнений после ИМ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта статья была направлена на описание протокола выделения единичных некардиомиоцитов из сердца мыши после ИМ. Протокол может быть применен для выделения различных типов клеток в микроокружении после инфаркта миокарда с высоким качеством, включая иммунные клетки, эндотелиальные кле?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондами естественных наук провинции Чжэцзян (LQ22H020010).
Materials
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
