Herstellung einer Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung aus einem erwachsenen Mausherzen nach Myokardinfarkt
Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung einer ausreichenden Anzahl einzelner nicht-kardiomyozyten mit hoher Viabilität aus einem Mausherzen nach einem Myokardinfarkt (MI). Dies kann für die anschließende Einzelzellsequenzierung, Durchflusszytometrie-Analyse und primäre Zellkultur verwendet werden.
Abstract
Der Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit weltweit steigender Sterblichkeit. Nicht-Kardiomyozyten machen mehr als die Hälfte der gesamten Herzzellpopulation aus und tragen zur adaptiven Kompensation von Myokardverletzungen bei, einschließlich Entzündungsreaktionen, Gewebereparatur und Narbenbildung. Um die kardiale Mikroumgebung nach einem MI zu untersuchen, wird die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) häufig verwendet, um verschiedene Herzzelltypen und interzelluläre Kommunikation zu identifizieren. Unter den Verfahren der scRNA-seq-Probenvorbereitung ist die Herstellung der Zellsuspension einer der kritischsten Schritte, da die Zellviabilität die Qualität der scRNA-seq-Ergebnisse beeinflussen kann. Daher haben wir ein experimentelles Protokoll zur Herstellung einer nicht-kardiomyozytenartigen Zellsuspension aus Mäuseherzen nach einem Myokardinfarkt entwickelt, wobei der Schwerpunkt auf der Verbesserung der Zelllebensfähigkeit durch die Auswahl milder Verdauungsenzyme, die Kontrolle der Verdauungszeit und die Anwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) liegt. Schließlich isolierten wir CD45+ -Zellen aus der durch dieses Protokoll erhaltenen Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension und führten dann scRNA-seq durch.
Introduction
Der Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen, deren Sterblichkeit weltweit zunimmt1. Der Myokardinfarkt wird durch eine unzureichende Durchblutung des umgebenden Myokards verursacht, was auf einen Verschluss der Koronararterien zurückzuführen sein kann, der bei einer atherosklerotischen Plaqueruptur auftritt. Obwohl die perkutane Koronarintervention (PCI) die Sterblichkeitsraten von Patienten mit akutem Myokardinfarkt gesenkt hat, bleibt die hohe Prävalenz der Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt ein Problem2. Die wichtigste Pathophysiologie, die der Herzinsuffizienz nach einem Herzinfarkt zugrunde liegt, ist die kompensatorische Reaktion des Körpers auf Herzverletzungen, bei der der abgestorbene Herzmuskel durch nicht-kontraktile fibrotische Narben ersetzt wird. Diese adaptiven Reaktionen beruhen maßgeblich auf lokalen Entzündungen, die durch die Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen und Herzgewebezellen vermittelt werden, und diese Entzündung wird nun als potenzielles therapeutisches Ziel angesehen, um die fibrotische Narbenbildung zu reduzieren und somit vor einer Herzinsuffizienz nach einem Myokardinfarkt zu schützen 3,4. Interessanterweise erfährt die Mikroumgebung an der Infarktstelle einen zeitabhängigen Übergang der infiltrierenden Zelltypen und -funktionen in verschiedenen Stadien von MI 1,5. Viele Studien haben gezeigt, dass Nicht-Kardiomyozyten (z. B. Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen) eine zentrale Rolle bei der Entzündung nach einem Myokardinfarkt und der Gewebereparatur spielen 5,6. In den letzten Jahren wurde die Einzelzellsequenzierung in großem Umfang als leistungsfähiges Werkzeug zur Aufklärung der Beteiligung und Funktion von Nicht-Kardiomyozyten in der Mikroumgebung nach einem Myokardinfarkteingesetzt 7,8. Dies gibt Einblicke in die Pathophysiologie der Post-MI-Verletzung und -Reparatur sowie in die Entwicklung potenzieller Therapien gegen die Post-MI-Herzinsuffizienz.
Die Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist eine Technik, mit der ganze Transkriptome mithilfe von Next-Generation-Sequencing (NGS) sehr detailliert untersucht werden können7,8,9. In jüngster Zeit hat die Entwicklung von scRNA-Seq das biomedizinische Forschungsfeld revolutioniert. Im Vergleich zur konventionellen Massensequenzierung analysiert scRNA-Seq Genexpressionsprofile und transkriptionelle Heterogenität auf Einzelzellebene 7,8. Diese Technik fördert maßgeblich die Erforschung der zellulären Pathophysiologie von MI 9,10, indem sie verschiedene zirkulierende Zelltypen in der Post-MI-Mikroumgebung identifiziert und die Interaktion zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Kardiomyozyten aufdeckt. Diese Ergebnisse tragen außerdem dazu bei, neue therapeutische Angriffspunkte für die Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt zu finden. Im Allgemeinen umfasst das scRNA-seq-basierte Post-MI-Experiment drei Hauptabschnitte: (1) die Etablierung eines Post-MI-Tiermodells; (2) die Herstellung der Zellsuspension; und (3) Probensequenzierung und Datenanalyse. Auffällig ist, dass die Herstellung der Zellsuspension der kritischste Schritt bei der Vorbereitung des scRNA-Seq-Experiments ist, da die Qualität der Zellsuspension die Genauigkeit der Ergebnisse bestimmt.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension aus dem Herzgewebe nach einem Myokardinfarkt zu extrahieren. Bezeichnenderweise sind die spezifischen Details zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Auflösung der Zellen enthalten. Inzwischen sind die in diesem Protokoll verwendeten Geräte, wie z. B. chirurgische Kits für Mäuse, Beatmungsgeräte für Nagetiere und Zentrifugen, in den meisten Tierversuchszentren und biomedizinischen Labors zu finden, und daher sind die Versuchskosten für dieses Protokoll relativ gering. Darüber hinaus kann dieses Protokoll unter Berücksichtigung von Zeitpunkten und Infarktorten als Variablen angewendet werden, um eine Vielzahl von klinischen Szenarien zu simulieren, insbesondere für die Komplikationen nach dem Myokardinfarkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ziel dieses Artikels war es, ein Protokoll zur Isolierung einzelner Nicht-Kardiomyozyten aus Mäuseherzen nach Myokardinfarkt zu beschreiben. Das Protokoll kann angewendet werden, um verschiedene Zelltypen in der Post-MI-Mikroumgebung mit hoher Qualität zu isolieren, darunter Immunzellen, Endothelzellen und Fibroblasten. Drei wesentliche Faktoren sind entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Zellsuspension für die Einzelzellsequenzierung zu erhalten. Die erste ist die Einstellung der enzymatischen Verdauung. Es ist…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Natural Science Funds der Provinz Zhejiang unterstützt (LQ22H020010).
Materials
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
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