체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가
Summary
이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.
Abstract
백신의 주성분으로서 보조제는 항원과 관련된 강력하고 광범위하며 선천적이며 적응적인 면역 반응을 직접 유도하거나 향상시킬 수 있습니다. 오피오포곤 자포 니쿠스 식물에서 추출한 정제 성분인 오피오포고닌 D(OP-D)는 백신 보조제로 유용한 것으로 밝혀졌습니다. OP-D의 낮은 용해도 및 독성 문제는 저에너지 유화 방법을 사용하여 나노 에멀젼 오피오포고닌 D(NOD)를 제조함으로써 효과적으로 극복할 수 있습니다. 이 기사에서는 세포 활동 평가를 위한 일련의 시험관 내 프로토콜을 검사합니다. L929의 세포독성 효과는 세포 계수 키트-8 분석을 사용하여 결정하였다. 이어서, 면역화된 마우스로부터 비장세포를 자극하고 배양한 후에 분비된 사이토카인 수치 및 상응하는 면역세포수를 ELISA 및 ELISpot 방법으로 검출하였다. 또한, C57BL/6 마우스로부터 분리되고 GM-CSF와 IL-4로 배양한 후 성숙된 골수 유래 수지상 세포(BMDC)의 항원 흡수능을 레이저 스캐닝 공초점 현미경(CLSM)으로 관찰하였다. 중요하게는, 대식세포 활성화는 24시간 동안 보조제와 함께 빈 마우스로부터의 복막 대식세포 (PMs)를 공동 배양한 후 ELISA 키트에 의해 IL-1β, IL-6, 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 사이토카인의 수준을 측정함으로써 확인되었다. 이 프로토콜이 다른 연구자들에게 새로운 백신 보조제의 세포 반응 효율성을 평가하기 위한 직접적이고 효과적인 실험적 접근 방식을 제공할 것으로 기대됩니다.
Introduction
백신은 전염성 및 비 전염성 질병을 예방하고 치료하는 중요한 수단입니다. 백신 제형에 보조제 및 전달 비히클의 적절한 첨가는 항원의 면역원성을 향상시키고 오래 지속되는면역 반응을 생성하는 데 유익합니다1. 고전적인 보조제 명반 (알루미늄 염) 외에도 현재 판매되는 백신 용 보조제에는 MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 및 Matrix-M5의 6 가지 보조제가 있습니다. 일반적으로 인체가 바이러스 공격을 받으면 1, 2차 방어선(피부, 점막, 대식세포)이 주도적으로 바이러스를 제거하고, 마지막으로 면역기관과 면역세포를 포함하는 3차 방어선이 활성화된다. 알루미늄 및 알루미늄 염은 1920년대 초부터 인간 백신에 가장 널리 사용되는 보조제였으며 효과적인 선천성면역 반응을 유도했습니다6. 그러나, 면역 세포가 특정 세트의 사이토카인 및 케모카인을 생성하도록 자극하는 고전적인 보조제에 의한 항원 제시 세포(APC)의 활성화는 보조제가 작동하는 메커니즘이며 보조제가 특정면역 반응에 일시적인 효과만 발휘하는 이유 중 하나일 수 있다고 제안되었습니다7. 인간 사용을 위한 제한된 허가된 보조제의 존재는 효과적인면역 반응을 유도하는 백신 개발을 위한 제한 요소입니다8.
현재, 점점 더 많은 보조 연구가 마우스에서 강력한 세포 면역 반응을 유도하는 능력을 입증하고 있습니다. QS-21은 균형 잡힌 T- 헬퍼 1 (Th1) 및 T- 헬퍼 2 (Th2) 면역 반응을 유도하고, 더 높은 수준의 항체 역가를 생성하고, 보조제로서의 보호를 연장시키는 것으로 나타 났지만, 강한 독성 및 용혈 특성으로 인해 독립형 임상 보조제 9,10. OP-D (루스코게닌-O-α-L-람노피라노시1-(1→2)-β-D-자일로피라노실-(1→3)-β-D-푸카피라노사이드)는 중국 약용 식물 오피오포곤 자포니카스4의 뿌리에서 분리된 스테로이드성 사포닌 중 하나입니다. 또한, 그것은 Radix Ophiopogonis에서 발견되는 주요 약리학 적 활성 성분 (Shen Mai San)이며 특정 약리학 적 특성을 갖는 것으로 알려져 있습니다11. 또한, 그것은 백합과에 속하며 세포 염증 및 심근 손상에 대한 억제 및 보호 효과로 널리 활용됩니다. 예를 들어, OP-D는 BALB/c 마우스12에서 DNCB 유발 아토피 피부염 유사 병변 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 염증성 HaCaT 세포를 개선합니다. 중요하게도, OP-D는 심혈 관계의 항산화 보호를 촉진하고 활성 산소 종 생성을 줄이고 미토콘드리아 막 손상을 방해하여 독소루비신 유발자가 포식 손상으로부터 심장을 보호합니다. 실험에 따르면 모노 데스모사이드와 함께 OP-D를 복용하면 면역 건강을 강화하고 백혈구 수와 DNA 합성을 증가시키며 항체를 더 오래 지속하는 데 도움이 됩니다13. OP-D는 보조 효과14를 갖는 것으로 이전에 밝혀졌다.
나노 에멀젼은 계면 활성제, 오일, 보조 계면 활성제 및 물12,15의 조합으로 구성된 수 중유 나노 제형입니다. 이러한 나노백신 설계는 항원과 보조제를 함께 캡슐화하여 면역 자극을 강화하고 항원을 보호하며 수지상 세포(DC) 성숙을 촉진합니다16. 스크리닝으로부터 수득된 이들 신규한 보조제의 개발을 위해서는, 이들의 세포 반응 능력을 평가하기 위한 적절한 방법을 찾는 것이 중요하다.
이 프로토콜의 목적은 보조제가 시험관 내 세포 배양에서 식균 작용 및 면역 세포의 발현을 향상시킬 수 있는지 체계적으로 평가하고 주요 실험 방법을 자세히 설명하는 것입니다. 실험은 4 개의 하위 섹션으로 나뉩니다 : (1) L929 세포에 대한 OP-D 및 NOD의 독성은 세포 계수 키트 -8 (CCK-8) 분석에 의해 결정됩니다. (2) 면역화 된 마우스에서 내분비 IFN-γ 및 IL-17A의 사이토 카인 수준과 상응하는 세포 수는 비장 세포 자극 및 ELISpot 분석에 의해 검출되고; (3) 보조 자극 후 DCs의 항원 제시 능력은 공초점 현미경을 사용하여 관찰되고; 및 (4) 보조제와 함께 공동 배양된 정상 마우스의 복막 대식세포(PMs)로부터 수득된 상청액에서 3가지 사이토카인, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α가 검출된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
서브유닛 백신은 안전성은 우수하지만 면역원성은 좋지 않습니다. 면역원성을 향상시키기 위한 주요 전략은 항원을 보조제와 물리적으로 흡착하거나 결합하고 이를 약물 전달 시스템에 통합하여 DC의 흡수 및 제시를 촉진하는 것입니다. 퀼라이아 사포닌 및 그 유도체와 같은 천연 식물 사포닌은 독성이 강하며 인간 백신 개발에 적합하지 않습니다17. 따라서 백신이나 보조제가 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램의 보조금 번호 2021YFC2302603, 중국 국립 자연 과학 재단 프로그램의 보조금 번호 31670938, 32070924, 82041045 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 보조금 번호 2014jcyjA0107 및 2019jcyjA-msxmx0159, 보조금 번호. 충칭의 대학원 연구 및 혁신 프로젝트의 CYS21519, 육군 의과 대학 특별 프로젝트의 보조금 번호 2020XBK24 및 대학생을위한 국가 혁신 및 기업가 정신 프로그램 202090031021 번 부여.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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