İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi
Summary
Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.
Abstract
Aşıların temel bir bileşeni olarak, adjuvanlar antijenlerle ilişkili güçlü, yaygın, doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları doğrudan indükleyebilir veya artırabilir. Ophiopogon japonicus bitkisinden ekstrakte edilen saflaştırılmış bir bileşen olan Ophiopogonin D (OP-D), bir aşı adjuvanı olarak yararlı bulunmuştur. OP-D’nin düşük çözünürlüğü ve toksisitesi sorunları, nanoemülsiyon ofiyopogonin D (NOD) hazırlamak için düşük enerjili bir emülsifikasyon yöntemi kullanılarak etkili bir şekilde üstesinden gelinebilir. Bu makalede, hücresel aktivitenin değerlendirilmesi için bir dizi in vitro protokol incelenmiştir. L929’un sitotoksik etkileri, hücre sayma kit-8 testi kullanılarak belirlendi. Daha sonra, immünize farelerden splenositlerin stimülasyonu ve kültürü sonrasında salgılanan sitokin düzeyleri ve buna karşılık gelen immün hücre sayıları ELISA ve ELISpot yöntemleri ile tespit edildi. Ek olarak, C57BL / 6 farelerden izole edilen ve GM-CSF artı IL-4 ile inkübasyondan sonra olgunlaşan kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerde (BMDC’ler) antijen alım yeteneği, lazer taramalı konfokal mikroskopi (CLSM) ile gözlenmiştir. Önemli olarak, makrofaj aktivasyonu, IL-1β, IL-6 ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) sitokinlerinin seviyelerinin, boş farelerden peritoneal makrofajların (PM’ler) adjuvanla 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesinden sonra ELISA kitleri ile ölçülmesiyle doğrulandı. Bu protokolün, diğer araştırmacılara yeni aşı adjuvanlarının hücresel yanıt etkinliklerini değerlendirmek için doğrudan ve etkili deneysel yaklaşımlar sağlayacağı umulmaktadır.
Introduction
Aşılar, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde önemli bir araçtır. Aşı formülasyonlarına adjuvanların ve dağıtım araçlarının uygun şekilde eklenmesi, antijenlerin immünojenitesini arttırmak ve uzun süreli immün yanıtlar oluşturmak için faydalıdır1. Klasik adjuvan şaplara (alüminyum tuzu) ek olarak, şu anda pazarlanan aşılar için altı çeşit adjuvan vardır: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 ve Matrix-M5. Genel olarak, insan vücudu viral bir saldırıyla karşılaştığında, birinci ve ikinci savunma hatları (cilt, mukoza ve makrofajlar) virüsün temizlenmesinde öncülük eder ve son olarak, bağışıklık organlarını ve bağışıklık hücrelerini içeren üçüncü savunma hattı aktive edilir. Alüminyum ve alüminyum tuzları, 1920’lerin başından beri insan aşıları için en yaygın kullanılan adjuvanlar olmuştur ve etkili bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmıştır6. Bununla birlikte, antijen sunan hücrelerin (APC’ler) klasik adjuvanlar tarafından aktivasyonunun, immün hücreleri spesifik sitokin ve kemokin setleri üretmeye teşvik eden, adjuvanların çalıştığı mekanizma olduğu ve adjuvanların spesifik immün yanıtlar üzerinde sadece geçici etkiler göstermesinin nedenlerinden biri olabileceği öne sürülmüştür7. İnsan kullanımı için sınırlı lisanslı adjuvanların varlığı, etkili bağışıklık tepkilerini ortaya çıkaran aşıların geliştirilmesinde kısıtlayıcı bir faktördür8.
Şu anda, artan sayıda adjuvan çalışma, farelerde güçlü bir hücresel bağışıklık tepkisi indükleme yeteneğini göstermektedir. QS-21’in dengeli bir T-helper 1 (Th1) ve T-helper 2 (Th2) immün yanıtını indüklediği, daha yüksek seviyelerde antikor titreleri ürettiği ve bir adjuvan olarak korumayı uzattığı gösterilmiştir, ancak güçlü toksisitesi ve hemolitik özellikleri, bağımsız bir klinik adjuvan 9,10 olarak gelişimini sınırlar. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside), Çin şifalı bitkisi Ophiopogon japonicas4’ün kökünden izole edilen steroidal saponinlerden biridir. Ek olarak, Radix Ophiopogonis’te bulunan baş farmakolojik olarak aktif bileşendir (Shen Mai San) ve bazı farmakolojik özelliklere sahip olduğu bilinmektedir11. Ayrıca, Liliaceae ailesinin bir üyesidir ve hücresel inflamasyon ve miyokard hasarında inhibitör ve koruyucu etkileri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, OP-D, BALB / C farelerde DNCB ile indüklenen atopik dermatit benzeri lezyonları ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) inflamatuar HaCaT hücrelerini iyileştirir12. Önemli olarak, OP-D, kardiyovasküler sistemin antioksidatif korumasını teşvik eder ve hem reaktif oksijen türlerinin üretimini azaltarak hem de mitokondriyal membran hasarını bozarak kalbi doksorubisin kaynaklı otofajik hasara karşı korur. Deneyler, OP-D’yi mono-desmosid ile almanın bağışıklık sağlığını artırmaya, beyaz kan hücresi sayımlarını ve DNA sentezini artırmaya ve antikorların daha uzun süre dayanmasına yardımcı olduğunu göstermiştir13. Daha önce OP-D’nin adjuvan etkisi olduğu bulunmuştur14.
Nanoemülsiyonlar, yüzey aktif maddeler, yağ, kosürfaktanlar ve su12,15’in bir kombinasyonundan oluşan su içinde yağ nanoformülasyonlarıdır. Bu nanoaşı tasarımları, immün stimülasyonu arttırmak, antijenleri korumak ve dendritik hücre (DC) olgunlaşmasını teşvik etmek için antijenlerin ve adjuvanların birlikte kapsüllenmesine izin verir16. Taramadan elde edilen bu yeni adjuvanların gelişimi için, hücresel yanıt yeteneklerini değerlendirmek için uygun yöntemler bulmak önemlidir.
Bu protokolün amacı, adjuvanların fagositozu ve immün hücrelerin in vitro hücre kültüründeki ekspresyonunu artırıp artıramayacağını sistematik olarak değerlendirmek ve ana deneysel yöntemleri detaylandırmaktır. Deney dört alt bölüme ayrılmıştır: (1) OP-D ve NOD’nin L929 hücrelerine toksisitesi, hücre sayma kit-8 (CCK-8) testi ile belirlenir; (2) endokrin IFN-γ ve IL-17A’nın sitokin seviyeleri ve immünize farelerde karşılık gelen hücre sayıları splenosit stimülasyonu ve ELISpot testleri ile tespit edilir; (3) Adjuvan stimülasyondan sonra DC’lerin antijen sunum kabiliyeti konfokal mikroskopi kullanılarak gözlenir; ve (4) adjuvanlarla birlikte kültürlenmiş normal farelerde periton makrofajlarından (PM’ler) elde edilen süpernatantlarda üç çeşit sitokin, IL-1β, IL-6 ve TNF-α tespit edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alt ünite aşılar mükemmel güvenlik sağlar, ancak immünojenisitesi zayıftır. İmmünojeniteyi arttırmanın ana stratejisi, antijenleri adjuvanlarla fiziksel olarak adsorbe etmek veya eşleştirmek ve DC’ler tarafından alımını ve sunumunu teşvik etmek için bunları ilaç dağıtım sistemlerine dahil etmektir. quillaia saponin ve türevleri gibi doğal bitki saponinleri oldukça toksiktir ve insan aşılarının geliştirilmesi için uygun değildir17. Bu nedenle, aşıların veya ad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı’nın 2021YFC2302603 numaralı hibesi, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Programı’nın 31670938, 32070924, 82041045 ve 32000651 No’lu hibeleri, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı’nın 2014jcyjA0107 ve 2019jcyjA-msxmx0159 no’lu hibeleri, Chongqing’in Lisansüstü Araştırma ve İnovasyon Projesi’nin CYS21519 no’lu hibesi, Ordu Tıp Üniversitesi Özel projelerinin 2020XBK24 numaralı hibesi ve üniversite öğrencileri için Ulusal İnovasyon ve Girişimcilik Programı’nın 202090031021 numaralı hibe.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years – United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D’ in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
