Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas
Summary
A amplificação do sinal de tiramida durante a coloração imunofluorescente permite a detecção sensível de RIPK3 fosforilado e MLKL durante necroptose induzida por ZBP1 após infecção por HSV-1.
Abstract
A proteína quinase 3 (RIPK3) e sua linhagem mista quinase quinase (MLKL) são reguladores críticos da necroptose, uma forma inflamatória de morte celular com importantes funções antivirais. A autofosforilação do RIPK3 induz a fosforilação e a ativação da proteína executora formadora de poros da necroptose MLKL. O tráfico e a oligomerização da MLKL fosforilada na membrana celular resultam em lise celular, característica da morte celular necroptótica. O sensor de ácido nucleico ZBP1 é ativado ligando-se ao RNA DE FITA DUPLA (Z-RNA) da forma Z canhoto após a infecção por vírus de RNA e DNA. A ativação do ZBP1 restringe a infecção pelo vírus, induzindo a morte celular regulada, incluindo necroptose, de células hospedeiras infectadas. A microscopia de imunofluorescência permite a visualização de diferentes etapas de sinalização a jusante da necroptose mediada por ZBP1 por célula. No entanto, a sensibilidade da microscopia de fluorescência padrão, usando anticorpos fosfo-específicos atualmente disponíveis comercialmente contra RIPK3 e MLKL humanos, impede a imagem reprodutível desses marcadores. Aqui, descrevemos um procedimento de coloração otimizado para serina (S) fosforilada RIPK3 (S227) e MLKL (S358) em células HT-29 humanas infectadas com o vírus herpes simplex 1 (HSV-1). A inclusão de uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) no protocolo de coloração imunofluorescente permite a detecção específica de RIPK3 fosforilado S227. Além disso, a TSA aumenta muito a sensibilidade da detecção de MLKL fosforilado S358. Juntos, esse método permite a visualização desses dois eventos críticos de sinalização durante a indução da necroptose induzida por ZBP1.
Introduction
A serina/treonina proteína quinase 3 (RIPK3) e a quinase de linhagem mista (MLKL) são reguladores centrais da morte celular necroptótica 1,2. A necroptose é uma forma lítica e inflamatória de morte celular regulada envolvida na imunidade antiviral e na autoinflamação. A necroptose de células infectadas por vírus interrompe imediatamente a replicação do vírus. A lise celular após a indução da necroptose também libera padrões moleculares associados a danos, que estimulam a imunidade antiviral 3,4. A necroptose é iniciada pela ativação da RIPK3 após interações mediadas por motivo de interação homotípica RIP (RHIM) com uma das três moléculas ativadoras a montante: RIPK1 (no engajamento do receptor de TNF 1 [TNFR1]), β de interferon indutor de adaptador contendo domínio TIR (TRIF; no engajamento do receptor Toll-like 3 e 4), ou o sensor de ácido nucleico antiviral Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . A sinalização da necroptose prossegue através de uma série de eventos de fosforilação começando com a autofosforilação do RIPK3. A autofosforilação da RIPK3 humana na serina (S)227 dentro de seu domínio da quinase é um pré-requisito para a necroptose, permitindo a interação com a MLKL e é comumente usada como marcador bioquímico para ativação da RIPK3 humana e morte celular necroptótica 1,5. Uma vez ativado, o RIPK3 fosforila o loop de ativação do MLKL na treonina (T)357 e S3581. Isso causa uma mudança na conformação do MLKL, resultando na exposição do domínio do feixe de quatro hélices N-terminal. O MLKL então oligomeriza e trafega para a membrana celular, onde forma um poro através da inserção dos quatro feixes de hélices expostos na bicamada lipídica, levando eventualmente à morte celular 2,6.
ZBP1 é um sensor de ácido nucleico antiviral que reconhece ácidos nucleicos canhotos da forma Z, incluindo RNA de fita dupla na conformação Z (Z-RNA). A ligação do Z-RNA ocorre através de dois domínios Zα posicionados no terminal N do ZBP1. Acredita-se que o Z-RNA que se acumula durante a infecção por vírus de RNA e DNA envolva diretamente o ZBP1 7,8. O ZBP1 ativado recruta RIPK3 através de seus RHIMs centrais e induz a morte celular regulada, incluindo necroptose 9,10. Os vírus adotaram inúmeros mecanismos de escape para neutralizar a necroptose de células hospedeiras induzida porZBP11 11. Por exemplo, a subunidade 1 da ribonucleotídeo redutase do vírus herpes simplex 1 (HSV-1), conhecida como ICP6 e codificada pelo UL39, abriga o RHIM em seu N-terminal que interfere na ativação do RIPK3 mediado por ZBP1 em células humanas12,13,14,15. O ZBP1 não apenas restringe a replicação viral, mas estudos em camundongos mostraram que a ativação do ZBP1 causa doenças inflamatórias e estimula a imunidade ao câncer 16,17,18,19,20,21. Protocolos que detectam eventos de sinalização que ocorrem durante a necroptose induzida por ZBP1 em células humanas são, portanto, valiosos para avaliar o papel do ZBP1 nesses processos.
A amplificação de sinal de tiramida (TSA), também conhecida como deposição catalisada de repórter (CARD), foi desenvolvida para melhorar o limite de detecção e a relação sinal-ruído em imunoensaios baseados em anticorpos. Durante a TSA, qualquer anticorpo primário pode ser usado para detectar o antígeno de interesse. A peroxidase de rábano (HRP), acoplada a um anticorpo secundário, catalisa o acúmulo local de radicais de tiramida biotinilados na presença de peróxido de hidrogênio. Esses radicais de biotina-tiramida ativados então reagem com resíduos proximais de tirosina para formar ligações covalentes. Potenciais substratos de tiramida-biotina incluem o próprio antígeno, os anticorpos primários e secundários e proteínas vizinhas. Assim, enquanto a TSA melhora significativamente a sensibilidade do ensaio, parte de sua resolução espacial é perdida. Em uma etapa final, as moléculas de biotina são detectadas usando treptavidina marcada fluorescentemente. A reação HRP deposita muitas moléculas de tiramida-biotina sobre ou perto do antígeno de interesse. Isso aumenta muito o número de sítios de ligação treptavidina-fluorocromo, ampliando consideravelmente a sensibilidade do ensaio (Figura 1). Alternativamente, a tiraamida pode ser diretamente acoplada a um fluorocromo, eliminando a necessidade de fluoróforos acoplados à estreptavidina. A imuno-histoquímica proteica e a hibridização in situ DNA/RNA estavam entre os primeiros métodos pelos quais a ATS foi empregada para melhorar as intensidades de sinal22,23. Mais recentemente, a AST tem sido combinada com citometria de fluxo intracelular24 e espectrometria de massas25.
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar serina 227 RIPK3 humana fosforilada (p-RIPK3 [S227]) e MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) após a ativação de ZBP1 por infecção por HSV-1 usando microscopia de imunofluorescência. Usamos uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 sensível à necroptose que foi transduzida para expressar de forma estável a ZBP1 humana. Essas células foram infectadas com uma cepa de HSV-1 expressando uma proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) na qual quatro aminoácidos centrais dentro da IHMI viral (VQCG) foram substituídos por alaninas (AAAA), tornando a ICP6 incapaz de bloquear a necroptose mediada porZBP1 13,14,15. Para superar o problema da baixa relação sinal-ruído dos anticorpos atualmente disponíveis comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 e p-MLKL na imunocoloração26, realizamos uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta na detecção robusta de p-RIPK3 humano (S227) e melhora a sensibilidade de detecção de p-MLKL humano (S358) em uma ordem de magnitude.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de coloração imunofluorescente descreve o uso de amplificação de sinal de tiramida (TSA) para aumentar a sensibilidade para eventos de sinalização da via de sinalização necroptótica humana que são difíceis de detectar, incluindo a fosforilação de RIPK3 e MLKL26. A inclusão de uma etapa TSA melhora significativamente o limiar de detecção de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta a sensibilidade do esforço p-MLKL (S358). A TSA revelou um sinal p-RIPK3 (S227) já pre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao VIB Bioimaging Core pelo treinamento, suporte e acesso ao parque de instrumentos. J.N. é apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação de Investigação Flandres (FWO). A investigação no grupo J.M. foi apoiada por uma bolsa Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), uma bolsa de investigação júnior (G031022N) da Fundação de Investigação da Flandres (FWO), uma bolsa de prova de conceito para jovens investigadores do CRIG e pela Universidade de Ghent. A investigação no grupo P.V. foi apoiada por EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), consórcios CRIG e GIGG e VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
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