우리는 이질적인 구조적 및 기계적 죽상경화성 플라크 특성을 연구하기 위해 기계 이미징 파이프라인을 개발했습니다. 이 파이프라인은 콜라겐 섬유 배향의 국소 우세 각도와 분산, 파열 거동 및 섬유질 플라크 조직의 변형 지문의 상관 관계를 가능하게 합니다.
관상 동맥 및 경동맥의 죽상 경화성 플라크의 파열은 치명적인 심혈관 사건의 주요 원인입니다. 그러나 이질적이고 콜라겐이 많은 플라크 조직의 파열 역학과 이것이 조직의 섬유 구조와 어떻게 관련되어 있는지는 아직 알려져 있지 않습니다. 플라크 역학을 연구하기 위한 기존 파이프라인은 조직의 구조적 균질성을 가정하여 플라크 조직의 총체적인 기계적 특성만을 얻는 것으로 제한됩니다. 그러나, 섬유질 플라크 조직은 구조적으로 이질적이며, 틀림없이 주로 콜라겐 섬유 구조의 국부적 변이로 인한 것입니다.
여기에 설명된 기계 이미징 파이프라인은 이질적인 구조적 및 기계적 플라크 특성을 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 파이프라인에서 조직의 국소 콜라겐 구조는 2차 고조파 생성(SHG)이 있는 다광자 현미경(MPM)을 사용하여 특성화되고 조직의 실패 거동은 디지털 이미지 상관관계(DIC) 분석을 사용하는 단축 인장 테스트 조건에서 특성화됩니다. 이 실험 파이프라인은 콜라겐 섬유 배향의 국소 우세 각도와 분산, 파열 거동 및 섬유질 플라크 조직의 변형 지문의 상관 관계를 가능하게 합니다. 얻은 지식은 죽상경화성 플라크 파열 사건을 더 잘 이해, 예측 및 예방하는 데 중요합니다.
종종 경동맥의 죽상동맥경화반 파열에 의해 유발되는 허혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인 중 하나입니다1. 그러나 경동맥 죽상동맥경화증 관련 뇌졸중을 예방하기 위한 현재의 외과적 치료 계획 전략에는 플라크 파열 위험 평가가 포함되어 있지 않다2. 이는 주로 플라크캡 두께3 및 지질 코어 크기4와 같은 이전에 제안된 위험 바이오마커가 향후 임상 사건에 대해 차선의 예측 값을 갖는 것으로 나타났기 때문입니다 5,6. 플라크 역학 및 파열 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 플라크 파열 위험 평가를 최적화하고 죽상동맥경화성 플라크의 새로운 위험 마커를 식별하는 데 필요합니다.
플라크 파열은 섬유질이 많은 플라크 조직이 혈압에 의해 가해지는 기계적 부하를 견디지 못하고 구조적 완전성을 잃는 국소적인 기계적 사건이다7. 그럼에도 불구하고, 플라크 파열 사건의 역학과 기본 미세 구조와의 연관성은 잘 이해되지 않고 있습니다8. 플라크 조직 파괴를 특징으로 하는 소수의 실험적 연구는 조직의 구조적 균질성을 가정하여 파생된 9,10,11,12,13개의 보고된 총 기계적 파열 특성(즉 , 극한 인장 파괴 변형률 및 강도)을 특징으로 합니다. 그러나, 섬유상 플라크 조직은 구조적으로 이질적이며, 틀림없이 주로 콜라겐 섬유 구조의 국부적 변이에 기인한다(14). 또한, 플라크 조직의 기계적 고장 특성과 콜라겐 구조 사이의 연관성은 Johnston et al.의 최근 연구에서만 조사되었습니다. 저자들은 우세한 섬유 방향에서 플라크 간 차이를 보였고 주로 원주 섬유 배향을 가진 섬유질 플라크 캡 샘플에 대해 더 높은 극한 응력과 더 낮은 극한 변형을 보고했습니다15. 그러나 이 연구는 또한 총체적인 기계적 및 구조적 특성에 국한되었습니다.
국소 콜라겐 구조와 섬유질 플라크 조직의 국소 기계적 특성에 대한 필수 정보를 밝히기 위해 현재 연구에서 우리는 기계 이미징 파이프라인을 개발했습니다. 이 생체 외 파이프라인을 사용하면 국소 콜라겐 섬유 방향 및 분산뿐만 아니라 국소 파열 변형률의 정량화가 가능합니다. 파이프라인에는 플라크 조직의 콜라겐 섬유를 이미지화하기 위한 SHG를 사용한 MPM 이미징과 조직의 파열 특성을 정량화하기 위한 DIC 및 단축 인장 테스트가 포함됩니다.
다광자 현미경-초고조파 생성(MPM-SHG)은 생체 조직에서 콜라겐을 연구하는 데 널리 사용되는 기술이 되었다16. 이 기술은 조직학(histology)17, 확산 텐서 이미징(diffusion tensor imaging, DTI)14 및 소각 광 산란(small-angle light scattering)15과 같은 다른 콜라겐 이미징 기술에 비해 많은 장점이 있습니다. 첫째, MPM-SHG 이미징은 비파괴적이므로 기계적 테스트18과 결합하는 것이 이상적입니다. 둘째, SHG 신호는 콜라겐에 특이적이므로 조직의 염색이 필요하지 않습니다. 긴 여기 파장(근적외선)으로 인해, 투과 깊이는 다른 현미경 기술보다 크다16. SHG 이미징으로 달성한 고해상도(μm 수준)는 개별 섬유의 시각화도 가능하게 합니다. 이는 콜라겐 섬유의 수, 콜라겐 섬유의 배향, 분포의 국소 정량화와 같은 많은 가능성을 제공한다19.
기계적 테스트와 결합된 디지털 이미지 상관관계(DIC)는 생물학적 조직(20)의 국소적인 기계적 특성을 얻기 위해 널리 사용되는 방법이다. DIC를 이용하면, 조직 표면에 적용된 스페클의 변위는 기계적 테스트(20) 동안 획득된 고속 카메라 이미지를 비교함으로써 추적된다. 이 이미지 후처리 방법은 시편(20 )의 전장 표면 변형을 추정하는 데 사용되며 조직(21)의 파열 거동을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.
현재 연구는 섬유성 죽상경화성 플라크 조직의 국소 콜라겐 방향과 분산, 국소 기계적 특성 및 파열 거동 사이의 상관관계를 연구하기 위한 기계 이미징 파이프라인 개발에 중점을 두었습니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 몇 가지 이유로 혁신적이다. 첫째, 기계적 하중 하에서 섬유상 플라크 조직의 국소 변형을 측정하기 위해 디지털 이미지 상관관계가 적용된 것은 이번이 처음입니다. 둘째, 이 프로토콜은 국소 변형 패턴과 섬유성 플라크 조직의 국소 콜라겐 구조 사이의 연관성을 분석하는 데 필요한 정보를 제공합니다. 국소 평가의 중요성은 조직의 이질적인 특성을 보여주는 결과 섹션에 제시된 균주 데이터와 콜라겐 데이터 모두에 의해 강조됩니다. 따라서 이 프로토콜에서 사용되는 것과 같은 국소 평가를 가능하게 하는 기술의 사용은 섬유질 플라크 특성에 대한 향후 연구에 권장됩니다.
테스트 샘플 준비는 이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나입니다. 경동맥 플라크는 주로 콜라겐 조직입니다. 그러나, 이들은 전체 플라크 기계적 거동에 영향을 미치는 것으로 간주되는 석회화를 함유할 수 있다36,37. 이 연구는 플라크의 섬유 조직 구성 요소에 초점을 맞추기 때문에 μCT 이미징38을 사용하여 테스트 샘플에서 석회화를 피할 수 있습니다. μCT를 사용할 수 없는 경우 플라크의 석회화된 영역을 감지하기 위해 MRI 또는 OCT39와 같은 다른 이미징 기술을 고려할 수 있습니다. 석회화가 없고 기계적 검사에 사용할 수 있을 만큼 충분히 큰 섬유질 조직 검사 샘플을 얻는 것은 심하게 석회화되거나 분산된 석회화를 포함하는 플라크에 대해 어려운 작업일 수 있습니다. 프로토콜의 또 다른 과제는 디지털 이미지 상관관계를 위한 최적의 스페클 패턴을 생성하는 것입니다. 최적의 DIC는 50:5028의 흑백 비율이 필요하며, 적절한 품질을 보장하기 위해 3-5픽셀(29)의 스페클 사이즈를 필요로 한다. 이러한 요구 사항을 충족하지 못하면 부정확한 국부 변형률 측정이 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 조직의 자연적 랜드마크가 명확하지 않은 경우 파열 위치를 SHG 이미지에 매핑하는 것이 어려울 수 있습니다. 이러한 샘플의 경우 이미징 전에 조직에 여러 기준 마커를 적용하는 것이 도움이 될 것입니다.
현재 프로토콜에 사용되는 MPM-SHG 기술은 상대적으로 침투 깊이가 큰 고해상도 및 비파괴 기술이기 때문에 다른 많은 콜라겐 이미징 기술보다 우수합니다. 그러나 MPM-SHG의 침투 깊이(<400μm)는 0.5mm에서 2mm 사이의 테스트 샘플의 전체 두께를 이미징할 수 없기 때문에 한계가 있습니다. 확산 텐서 자기 공명 영상(diffusion tensor magnetic resonance imaging, DT-MRI)을 이용한 최근 연구에서, 우리는 플라크 조직의 더 깊은 부분에서의 우세한 섬유 배향이 조직의 보다 표면적인 내강 부분에서의 배향과 다를 수 있음을 입증하였다14. 따라서 두꺼운 섬유질 플라크 조직 샘플의 더 깊은 부분에서 국소 콜라겐 구조와 국소 조직 역학과의 관계를 조사하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 이를 위해 편광 공간 주파수 영역 이미징(pSFDI)을 활용할 수 있습니다. 최근에 개발된 이 광학 이미징 기술은 승모판막 첨판에서 0.8mm 깊이의 섬유 배향을 측정할 수 있는 잠재력이 있는 것으로 보고되었다12. 또한 pSFDI는 빠른 획득을 제공하므로 현재 프로토콜의 경우처럼 타일을 선택하는 대신 전체 샘플 영역을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 현재 프로토콜의 또 다른 한계는 표면 변형만 식별할 수 있다는 것입니다. 향후 연구에서, 미러 어시스트 멀티뷰 DIC40 또는 디지털 체적 상관관계(DVC)41 가 체적, 지하 변형에 대한 추가 정보를 얻기 위해 이 프로토콜에 포함될 수 있다.
현재의 실험 프로토콜은 플라크 파열 역학 및 기본 미세 구조와의 관계에 대한 추가 정보를 얻기 위해 여러 가지 방법으로 추가로 확장되거나 수정될 수 있습니다. 첫째, 현재 프로토콜에는 원주 방향의 단축 인장 시험이 포함됩니다. 이러한 유형의 기계적 테스트는 플라크가 생체 내에서 주로 원주 방향으로 인장 스트레칭을 경험하기 때문에 선택되었습니다. 보다 포괄적인 기계적 특성화를 위해 이 프로토콜을 추가로 확장하여 팽창 테스트, 이축 테스트 또는 길이 방향의 단축 인장 테스트를 통합할 수 있습니다. 둘째, 현재 프로토콜은 DIC를 통해 국소 균주를 얻는 데에만 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 플라크 기계적 거동에 대한 보다 완전한 관점은 프로토콜에 국소 응력 분석을 포함함으로써 얻을 수 있지만 이를 위해서는 국소 강성의 특성화가 필요합니다. 현재로서는 도전적이지만, 이것은 역유한요소법(42,43) 및 가상필드법(44)과 같은 계산 기술에 의해 달성될 수 있다. 실험적 적응 외에도 몇 가지 추가 후처리 단계를 현재 프로토콜에 추가할 수도 있습니다. 첫째, 파열 위치만 식별하는 것이 아니라 획득한 고속 카메라 영상을 통해 균열 전파 경로를 식별할 수 있습니다. 이 전파 경로는 국부적 구조적 및 기계적 파라미터와 상관될 수 있습니다. 둘째, 파열 개시 위치는 설명된 프로토콜에서 시각적으로 확인되었습니다. 비생물학적 조직에 대한 이전 연구에서는 파열45를 감지하기 위해 DIC 변형률 측정의 불연속성을 사용했습니다. 이러한 자동 파열 감지를 플라크 조직에 적용하면 파열 감지의 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 마지막으로, 다른 콜라겐 이미징 기술에 비해 MPM-SHG의 가장 큰 장점은 개별 콜라겐 섬유를 시각화한다는 것입니다. 따라서 이 프로토콜을 통해 얻은 데이터는 콜라겐 함량과 같은 추가 국소 콜라겐 특성을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 생체 내에서 플라크 파열에서 기계적으로 실패하는 구성 요소인 섬유성 플라크 조직의 국소 특성에 대한 더 나은 이해를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이 정보는 환자의 플라크 파열을 예측하는 새로운 구조적 및 기능적 이미징 마커를 설정하는 데 필요합니다. 이전에 제안된 위험 바이오마커가 향후 임상 사건에 대해 차선의 예측 가치를 갖는 것으로 나타났기 때문에 이러한 새로운 마커가 필요합니다 5,6. 미래에, OCT 및 ps-OCT는 동맥계에서 섬유 조직을 확인하고 정량화할 수 있다(46,47,48). 또한, 균주는 국소 플라크 조성물49에 대한 대리 마커로 간주되었다. 따라서, 생체내 변형률 측정치(49)는 잠재적으로 환자에서 플라크 안정성의 식별에 도움이 될 수 있다. 그러나 얻은 결과를 생체 내 플라크 파열로 직접 번역하는 데는 주의해야 합니다. 첫째, 섬유상 플라크 조직은 이 프로토콜에서 사용되는 단방향 인장 하중보다 생체 내에서 더 복잡한 하중을 경험합니다. 둘째, 죽상동맥경화반은 다성분 구조입니다. 섬유상 플라크 조직 내의 생체내 스트레스 및 변형률 분포는 석회화와 같은 다른 플라크 성분의 존재 및 위치에 의해 영향을 받을 수 있다(37).
이 기계 이미징 파이프라인은 다른 콜라겐 조직을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 콜라겐의 글로벌 기계적 테스트 및 구조 이미징은 이미 생물학적 조직에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 콜라겐 구조뿐만 아니라 사전 고장 및 고장 특성에 대한 국소 평가는 이질적인 섬유 조직의 정확한 기계적 특성화에 중요합니다. 우리는 이 새로운 프로토콜의 구조가 여러 생물학적 조직의 미세 구조와 역학 사이의 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 제공할 것으로 기대합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 NWO-Vidi 보조금(18360)으로 자금을 지원받았습니다.
10 mm extension ring | Thorlabs Inc. | CML10 | |
15 mL tube | VWR | 525-0150 | |
20x APO water immersion objective | Leica | 507701 | |
3D Slicer software | N/A | Version 4.11 | |
50 mL tubes | VWR | 525-0156 | |
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm | Conrad | 4.01614E+12 | |
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating | Thorlabs | ||
Black tissue dye | Polysciences inc | 24113-2 | |
Camera lens, focal length 50 mm | Thorlabs Inc. | MVL50M1 | |
Camera stand | VWR | 241-0093, 241-7311 | |
Chameleon Ultra multiphoton laser | Coherent | ||
Compressor + air hose | JUN-AIR, Conrad | B07GB9HC62, 4016138577198 | |
Excel | Microsoft | Version 2208 | |
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm | Pattex | ||
Heating bath | N/A | Custom made | |
High-speed camera + imaging software | Pixelink-Navitar Inc. | PL-D725 | |
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) | N/A | ||
Image J | National Institute of Health | N/A | |
LAS-AF | Leica | Version 2.3 | Imaging software multiphoton microscope |
LEICA TCS SP5 II | Leica | Microscope used for SHG imaging | |
Lighting system | AMZ instruments | LED-60TB | Used to obtain clear images with the high-speed camera |
MATLAB | MathWorks | Version R2021A | |
MATLAB-based FibLab software | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool | Eindhoven University of Technology | N/A | |
MATLAB-based Ncorr software | Georgia Institute of Technology | Version 1.2 | |
Needles | Emerald | BDAM302986 | |
Petri dish (10 cm diameter) | VWR | BRND452000 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
Pasteur Pipettes | VWR | ELKA127-P511-000 | |
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm | PerkinElmer | CLS149276 | |
Ruler | Fine Science Tools | 1800030 | |
Sandpaper (P180) | Conrad | 4.00932E+12 | |
Side cutter | Conrad | 4.25084E+12 | |
Silicon elastomer base and curring agent (Sylgard 184) | VWR | 634165S | |
Tensile tester + software + clamps | N/A | Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.) | |
Torque screwdriver | Garant, Hoffman group | 659906 |