Ici, un système bicouche lipidique soutenu par nanobar est développé pour fournir une membrane synthétique avec une courbure définie qui permet la caractérisation de protéines ayant une capacité de détection de courbure in vitro.
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Article de méthode
Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La courbure de la membrane joue un rôle important dans divers processus essentiels des cellules, tels que la migration cellulaire, la division cellulaire et le trafic des vésicules. Il n’est pas seulement généré passivement par les activités cellulaires, mais régule également activement les interactions protéiques et est impliqué dans de nombreuses signaux intracellulaires. Ainsi, il est très utile d’examiner le rôle de la courbure de la membrane dans la régulation de la distribution et de la dynamique des protéines et des lipides. Récemment, de nombreuses techniques ont été développées pour étudier la relation entre la membrane courbe et la protéine in vitro. Par rapport aux techniques traditionnelles, la bicouche lipidique (SLB) nouvellement développée offre à la fois un débit élevé et une meilleure précision dans la génération de courbure de la membrane en formant une bicouche lipidique continue sur des réseaux à motifs de nanobarres avec une courbure membranaire prédéfinie et un contrôle plat local. La fluidité lipidique et la sensibilité des protéines aux membranes courbes peuvent être caractérisées quantitativement à l’aide de l’imagerie par microscopie à fluorescence. Ici, une procédure détaillée sur la façon de former un SLB sur des surfaces de verre fabriquées contenant des réseaux nanobar et la caractérisation des protéines sensibles à la courbure sur ces SLB sont introduites. En outre, les protocoles de réutilisation des nanopuces et de traitement d’images sont couverts. Au-delà du nanobar-SLB, ce protocole est facilement applicable à tous les types de copeaux de verre nanostructurés pour les études de détection de courbure.
Introduction
La courbure membranaire est un paramètre physique critique d’une cellule qui se produit dans une variété de processus cellulaires tels que la morphogenèse, la division cellulaire et la migration cellulaire1. Il est maintenant largement reconnu que la courbure de la membrane est au-delà d’un simple résultat d’événements cellulaires; Au lieu de cela, il est apparu comme un régulateur efficace des interactions protéiques et de la signalisation intracellulaire. Par exemple, plusieurs protéines impliquées dans l’endocytose médiée par la clathrine se lient préférentiellement à la membrane incurvée, entraînant la formation d’un point chaud pour l’endo....
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Protocole
1. Nettoyage de la nanopuce
- Placez la nanopuce dans un bécher de 10 mL avec le côté à motifs vers le haut.
REMARQUE: Cette nanopuce de quartz a été fabriquée par lithographie par faisceau d’électrons comme décrit précédemment21. La géométrie et la disposition de la nanostructure sur la puce peuvent être conçues sur mesure. Les tailles des nanobarres de gradient utilisées ici sont de 2000 nm de longueur, 600 nm de hauteur et 100 à 1000 nm de largeur (pas à pas de 100 nm). - Ajoutez soigneusement 1 mL d’acide sulfurique à 98% dans le bécher et assurez-vous que l’acide recouvre complètement l’avant et....
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Résultats
La conception nanobar est recommandée pour sonder les protéines de détection de courbure positive, qui contient un demi-cercle à chaque extrémité avec une courbure définie par la largeur nanobar et un contrôle de courbure plate/nulle localement au centre (Figure 2A, B). La formation réussie du SLB sur les nanobarres entraîne une distribution uniforme des signaux de marqueurs lipidiques sur toute la surface nanobaraire, comme le montre la figure 2C
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Discussion
Le système nanobar-SLB décrit ici offre une combinaison unique des avantages de plusieurs tests in vitro existants. Il révèle efficacement la liaison préférentielle des protéines aux membranes très incurvées comme le test de flottaison ou de sédimentation des liposomes, mais nécessite beaucoup moins d’échantillons et offre une courbure plus précisément définie sur des nanobarres individuelles 8,29. Il offre également une large gamme de courbures contrôlé.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent n’avoir aucun intérêt financier concurrent dans ce travail.
Remerciements
Nous remercions le Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) et le Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) de l’Université technologique de Nanyang (NTU) pour leur soutien à la fabrication de nanostructures et à l’imagerie SEM, la plate-forme de production de protéines (PPP) de l’École des sciences biologiques NTU pour la purification des protéines et l’École de génie chimique et biomédical NTU pour le microscope confocal. Ce travail est financé par le ministère de l’Éducation de Singapour (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 et MOE-T2EP30220-0009), l’Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) soutenu par un financement du MOE dans le cadre du p....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Éthanol anhydre | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Feuille d’aluminium | Diamant | RN0879999FU | |
| Flacon ambré | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Cerveau PS : L-&alpha ;-phosphatidylsérine (Cerveau, Porcin) (sel de sodium) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Schott-Duran | de 10 mL | SCOT211060804 | |
| bécher de 50 mL de bécher | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| de 1000 mL de bécher | Schott-Duran | SCOT211065408 | le deuxième contenant. |
| Chloroforme | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotons-tiges Watsons | |||
| 18:1 DGS-NTA(Ni) : 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)acide iminodiacétique)succinyl] (sel de nickel) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oeuf PC : L-&alpha ;-phosphatidylcholine (Oeuf, Poulet) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, École des sciences biologiques, Université technologique de Nanyang, Singapour | Protéines et peptide | |
| F-BAR+IDR | Production de protéines Plaftorm, École des sciences biologiques, Université technologique de Nanyang, Singapour | Protéines et peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, École des sciences biologiques, Université technologique de Nanyang, Singapour | Protéines et peptides | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, École des sciences biologiques, Université technologique de Nanyang, Singapour | Protéines et peptides | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Peroxyde d’hydrogène, 30 % (certifié ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR de l’homme FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Microscopie confocale à balayage laser | Zeiss ; | LSM 800 avec objectif à huile Airyscan | 100x (N.A.1.4). |
| Méthanol | Fisher scientifique | 10010240 | |
| Mini-extuder ; | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| Microtubes 1,5 mL | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018B | |
| Membrane hydrophile nuclépore, 0.1 &mu ; m | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydiméthylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydiméthylsiloxane (PDMS) Réticulant | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Nettoyeur plasma | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Nanopuce de quartz | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Hydroxyde de sodium ; | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sigma-Aldrich | 258105 | ||
| Texas Red DHPE : Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | ||
| Pince à épiler | Gooi | PDC-002-HP | |
| Nettoyeurs à ultrasons | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Dessiccateur sous vide | NUCERITE | 5312 | |
| Bain-marie | Julabo | TW8 |
Références
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Che....
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Réimpressions et autorisations
