Un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobar para el estudio de proteínas de detección de curvatura de membrana in vitro
Summary
Aquí, se desarrolla un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobarras para proporcionar una membrana sintética con una curvatura definida que permite la caracterización de proteínas con capacidad de detección de curvatura in vitro.
Abstract
La curvatura de la membrana juega un papel importante en varios procesos esenciales de las células, como la migración celular, la división celular y el tráfico de vesículas. No solo es generado pasivamente por actividades celulares, sino que también regula activamente las interacciones de proteínas y está involucrado en muchas señales intracelulares. Por lo tanto, es de gran valor examinar el papel de la curvatura de la membrana en la regulación de la distribución y dinámica de proteínas y lípidos. Recientemente, se han desarrollado muchas técnicas para estudiar la relación entre la membrana curva y la proteína in vitro. En comparación con las técnicas tradicionales, la bicapa lipídica (SLB) soportada por nanobar, recientemente desarrollada, ofrece un alto rendimiento y una mejor precisión en la generación de curvatura de membrana al formar una bicapa lipídica continua en matrices de nanobarras con patrones con una curvatura de membrana predefinida y control plano local. Tanto la fluidez lipídica como la sensibilidad proteica a las membranas curvas se pueden caracterizar cuantitativamente utilizando imágenes de microscopía de fluorescencia. Aquí, se presenta un procedimiento detallado sobre cómo formar un SLB en superficies de vidrio fabricadas que contienen matrices de nanobarras y la caracterización de proteínas sensibles a la curvatura en dicho SLB. Además, se cubren los protocolos para la reutilización de nanochips y el procesamiento de imágenes. Más allá del nanobar-SLB, este protocolo es fácilmente aplicable a todos los tipos de chips de vidrio nanoestructurado para estudios de detección de curvatura.
Introduction
La curvatura de la membrana es un parámetro físico crítico de una célula que ocurre en una variedad de procesos celulares como la morfogénesis, la división celular y la migración celular1. Ahora se reconoce ampliamente que la curvatura de la membrana va más allá de un simple resultado de eventos celulares; En cambio, se ha convertido en un regulador eficaz de las interacciones de proteínas y la señalización intracelular. Por ejemplo, se encontró que varias proteínas involucradas en la endocitosis mediada por clatrina se unen preferentemente a la membrana curva, lo que resulta en la formación de un punto caliente para la endocitosis2. Hay muchas causas diferentes de deformación de la membrana, como el tirón de la membrana por las fuerzas citoesqueléticas, la presencia de asimetría lipídica con grupos de cabeza de diferentes tamaños, la existencia de proteínas transmembrana con forma cónica, la acumulación de proteínas formadoras de membrana como las proteínas de dominio BAR (llamadas así por las proteínas Bin, anfifisina y Rvs), y la inserción del dominio de las hélices anfipáticas en la membrana1 . Curiosamente, estas proteínas y lípidos no solo deforman la membrana, sino que también pueden sentir la curvatura de la membrana y exhibir acumulación preferencial1. Por lo tanto, es crucial estudiar si y cómo las membranas con diferentes curvaturas alteran la distribución y la dinámica de las proteínas y lípidos unidos a ellas y los posibles impactos en los procesos intracelulares relacionados.
Se han desarrollado muchas técnicas para analizar la interacción entre la membrana curva y las proteínas tanto en células vivas como en sistemas in vitro. El sistema de células vivas proporciona un entorno celular real con rica diversidad lipídica y regulación dinámica de señalización proteica 2,3,4,5,6,7. Sin embargo, un sistema tan sofisticado es difícil de estudiar debido a las incertidumbres y fluctuaciones en el entorno intracelular. Por lo tanto, los ensayos in vitro utilizando una membrana artificial compuesta de especies lipídicas conocidas y proteínas purificadas se han convertido en poderosos sistemas de reconstitución para caracterizar la relación entre proteínas y membranas curvas. Tradicionalmente, los liposomas de diferentes diámetros se generan por extrusión para detectar proteínas sensibles a la curvatura mediante un ensayo de cosedimentación utilizando fuerza centrífuga o un ensayo de coflotación con un gradiente de densidad para evitar la agregación de proteínas 8,9. Sin embargo, la curvatura de los liposomas extruidos está limitada por el tamaño de poro disponible del filtro de membrana utilizado en la extrusora10. Se ha demostrado que el ensayo de curvatura de liposoma único (SLiC) supera esta limitación, en el que los liposomas con diferentes diámetros son marcados con fluorescencia e inmovilizados sobre la superficie para que la curvatura pueda ser marcada por la intensidad fluorescente11. Sin embargo, se ha observado una fuerte variabilidad en la composición lipídica en vesículas pequeñas, lo que afecta la precisión de la medición de la curvatura12. Los experimentos de tracción de la correa proporcionan una medición más precisa de la curvatura en la correa transitoria extraída de vesículas unilamelares gigantes (GUV) utilizando una pinza óptica, donde la curvatura puede ser bien controlada por la tensión de membrana generada13,14. Este método es adecuado para estudiar proteínas de detección de curvatura positiva o negativa, pero está limitado por el rendimiento de la generación de tubos10. El ensayo de tubos de membrana soportados (SMrT) permite la generación simultánea de múltiples tubos de membrana que se extruyen del mismo depósito de lípidos mediante flujos microfluídicos. Sin embargo, la curvatura de la membrana varía intrínsecamente a lo largo del nanotubo, lo que compromete la precisión de la medición de la curvatura basada en la intensidad de fluorescencia15,16. En comparación, el uso de pequeñas vesículas unilamelares (SUVs, diámetro <100 nm17) para formar una bicapa lipídica soportada (SLB) en superficies que contienen topografías diseñadas generó una sola membrana bicapa con curvaturas predeterminadas por nanofabricación o nanomateriales en alta precisión18,19,20.
Aquí, presentamos un protocolo para la formación del SLB en superficies de nanochips fabricadas con matrices de nanobarras y cómo se puede usar para probar la sensibilidad a la curvatura de proteínas in vitro. Como se muestra en la Figura 1, hay seis componentes esenciales del ensayo: A) Limpieza y montaje del chip con una cámara microfluídica; B) Preparación de SUV con composición lipídica definida; C) Formación del SLB en un nanochip y unión con proteínas sensibles a la curvatura; D) Obtención de imágenes y caracterización de las proteínas sensibles a SLB y curvatura bajo microscopía de fluorescencia; E) Limpieza del chip para su reutilización; F) Procesamiento de imágenes para el análisis cuantitativo de la capacidad de detección de curvatura de proteínas. El protocolo detallado se describe paso a paso a continuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema nanobar-SLB descrito aquí ofrece una combinación única de las ventajas en varios ensayos in vitro existentes. Revela eficientemente la unión preferencial de proteínas a membranas altamente curvadas como el ensayo de flotación o sedimentación de liposomas, pero requiere muchas menos muestras y ofrece una curvatura definida con mayor precisión en nanobarras individuales 8,29. También ofrece una amplia gama de curvatura controlada con pr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Centro de Nanofabricación de Nanyang (N2FC) y al Centro de Tecnologías Fotónicas Disruptivas (CDPT) de la Universidad Tecnológica de Nanyang (NTU) por apoyar la fabricación de nanoestructuras e imágenes SEM, la Plataforma de Producción de Proteínas (PPP) de la Escuela de Ciencias Biológicas NTU para la purificación de proteínas, y la Escuela de Ingeniería Química y Biomédica NTU para el microscopio confocal. Este trabajo está financiado por el Ministerio de Educación de Singapur (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 y MOE-T2EP30220-0009), el Instituto de Análisis y Ciencia Molecular Digital (IDMxS) apoyado por fondos del Ministerio de Educación bajo el esquema de Centros de Excelencia de Investigación (W. Zhao), la Fundación del Programa de Ciencia de la Frontera Humana (W. Zhao, RGY0088/2021), la Subvención de Inicio de NTU (W. Zhao), Escuela de Ingeniería Química y Biomédica NTU para la beca de investigación (X. Miao), y Consejo de Becas de China para la beca de investigación (J. Wu).
Materials
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
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