in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム
Summary
ここでは、ナノバー支持脂質二重層システムが開発され、 in vitroで曲率感知能力を有するタンパク質の特性評価を可能にする、定義された曲率を有する合成膜を提供する。
Abstract
膜湾曲は、細胞移動、細胞分裂、小胞輸送など、細胞のさまざまな重要なプロセスにおいて重要な役割を果たします。それは細胞活動によって受動的に生成されるだけでなく、タンパク質相互作用を積極的に調節し、そして多くの細胞内シグナル伝達に関与している。したがって、タンパク質と脂質の分布とダイナミクスの調節における膜湾曲の役割を調べることは非常に価値があります。最近、 in vitroで湾曲膜とタンパク質との関係を研究するために多くの技術が開発されている。従来の技術と比較して、新しく開発されたナノバー支持脂質二重層(SLB)は、事前に定義された膜曲率と局所的なフラットコントロールを備えたナノバーのパターン化されたアレイ上に連続的な脂質二重層を形成することにより、膜湾曲生成におけるハイスループットとより良い精度の両方を提供します。脂質の流動性と湾曲した膜に対するタンパク質の感受性の両方を、蛍光顕微鏡イメージングを使用して定量的に特徴付けることができます。ここでは、ナノバーアレイを含む作製したガラス表面にSLBを形成する方法と、そのようなSLB上の曲率感受性タンパク質の特性評価に関する詳細な手順を紹介します。さらに、ナノチップの再利用と画像処理のためのプロトコルについても説明します。nanobar-SLB以外にも、このプロトコルは曲率センシング研究用のあらゆるタイプのナノ構造ガラスチップに容易に適用できます。
Introduction
膜湾曲は、形態形成、細胞分裂、細胞移動などのさまざまな細胞プロセスで発生する細胞の重要な物理的パラメータです1。膜の湾曲は細胞イベントの単純な結果を超えていることが現在広く認識されています。代わりに、タンパク質相互作用と細胞内シグナル伝達の効果的な調節因子として浮上しています。例えば、クラスリン媒介性エンドサイトーシスに関与するいくつかのタンパク質は、湾曲した膜に優先的に結合し、エンドサイトーシスのホットスポットを形成することが見出された2。膜変形の原因は、細胞骨格力による膜の引っ張り、異なるサイズの頭部基を持つ脂質非対称性の存在、円錐形の膜貫通タンパク質の存在、BARドメインタンパク質(Bin、アンフィフィシン、Rvsタンパク質にちなんで名付けられた)などの膜形成タンパク質の蓄積、および両親媒性ヘリックスドメインの膜への挿入など、さまざまな原因があります1.興味深いことに、これらのタンパク質と脂質は膜を変形させるだけでなく、膜の湾曲を感知し、優先的な蓄積を示すことができます1。したがって、曲率の異なる膜が、それらに付着したタンパク質や脂質の分布や動態、および関連する細胞内プロセスへの潜在的な影響を変化させるかどうか、またどのように変化するかを研究することが重要です。
生細胞系とin vitro系の両方における湾曲膜とタンパク質の相互作用を分析するために、多くの技術が開発されてきました。生細胞システムは、豊富な脂質多様性と動的なタンパク質シグナル伝達調節を備えた実際の細胞環境を提供します2,3,4,5,6,7。しかし、このような洗練されたシステムは、細胞内環境の不確実性と変動のために研究が困難です。したがって、既知の脂質種と精製タンパク質で構成される人工膜を使用したin vitroアッセイは、タンパク質と湾曲した膜との関係を特徴付けるための強力な再構成システムになっています。伝統的に、異なる直径のリポソームは、遠心力を用いた共沈降アッセイまたはタンパク質凝集を回避するための密度勾配を有する共浮遊アッセイのいずれかを介して曲率感受性タンパク質を検出するために押出成形によって生成される8,9。しかしながら、押出リポソームの曲率は、押出機10で使用されるメンブレンフィルターの利用可能な孔径によって制限される。単一リポソーム曲率(SLiC)アッセイは、異なる直径を有するリポソームが蛍光標識され、表面に固定化され、曲率を蛍光強度によってマークすることができるというこの制限を克服することが証明されている11。しかしながら、脂質組成の強い変動は、小さな小胞において観察されており、これは曲率測定の精度に影響を及ぼす12。テザー引っ張り実験は、光ピンセットを使用して巨大な単層小胞(GUV)から引き出された過渡テザーの曲率のより正確な測定を提供し、曲率は生成された膜張力によって十分に制御することができる13,14。この方法は、正または負の曲率感知タンパク質の研究に適していますが、チューブジェネレーション10のスループットによって制約されます。サポートされているメンブレンチューブ(SMrT)アッセイは、マイクロ流体の流れによって同じ脂質リザーバーから押し出される複数のメンブレンチューブの同時生成を可能にします。それにもかかわらず、膜の曲率はナノチューブに沿って本質的に変化し、蛍光強度に基づく曲率測定の精度を損なう15,16。比較すると、小さな単層小胞(SUV、直径<100nm17)を使用して、設計されたトポグラフィーを含む表面に支持された脂質二重層(SLB)を形成し、ナノ加工またはナノ材料によって所定の曲率を有する単一の二層膜を高精度で生成した18、19、20。
ここでは、ナノバーアレイを用いて作製したナノチップ表面上にSLBを形成するためのプロトコルと、それを使用してin vitroでタンパク質の曲率感度を調べる方法を紹介します。 図1に示すように、アッセイには6つの必須コンポーネントがあります:A)マイクロ流体チャンバーによるチップの洗浄と組み立て。B)定義された脂質組成を有するSUVの調製;C)ナノチップ上でのSLBの形成および湾曲感受性タンパク質との結合;D)蛍光顕微鏡下でのSLBおよび曲率感受性タンパク質のイメージングおよび特性評価。E)再利用のためにチップをクリーニングする。F)タンパク質曲率感知能の定量的解析のための画像処理。詳細なプロトコルについては、以下で段階的に説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するnanobar-SLBシステムは、いくつかの既存のin vitroアッセイにおける利点のユニークな組み合わせを提供します。リポソーム浮遊または沈降アッセイとして、高度に湾曲した膜へのタンパク質の優先的な結合を効率的に明らかにしますが、必要なサンプルははるかに少なく、個々のナノバーでより正確に定義された曲率を提供します8,29…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ナノ構造製造とSEMイメージングをサポートしてくれた南洋ナノファブリケーションセンター(N2FC)と南洋理工大学(NTU)の破壊的フォトニックテクノロジーセンター(CDPT)、タンパク質精製のための生物科学院NTUのタンパク質生産プラットフォーム(PPP)、共焦点顕微鏡の化学生物医学工学部NTUに感謝します。この研究は、シンガポール教育省(MOE)(W. Zhao、RG112/20、RG95/21、およびMOE-T2EP30220-0009)、デジタル分子分析科学研究所(IDMxS)によって資金提供されており、研究センターオブエクセレンススキーム(W. Zhao)、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム財団(W. Zhao、RGY0088/2021)、NTUスタートアップグラント(W. Zhao)、 研究奨学金のための化学および生物医学工学NTUの学校(X.Miao)、および研究奨学金のための中国奨学金評議会(J.Wu)。
Materials
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
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