시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템
Summary
여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.
Abstract
막 곡률은 세포 이동, 세포 분열 및 소포 트래피킹과 같은 세포의 다양한 필수 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그것은 세포 활동에 의해 수동적으로 생성 될뿐만 아니라 단백질 상호 작용을 적극적으로 조절하고 많은 세포 내 신호 전달에 관여합니다. 따라서 단백질과 지질의 분포와 역학을 조절하는 막 곡률의 역할을 조사하는 것은 큰 가치가 있습니다. 최근에는 시험 관 내에서 곡선 막과 단백질 사이의 관계를 연구하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 기존 기술과 비교하여 새로 개발된 나노바 지지 지질 이중층(SLB)은 사전 정의된 막 곡률 및 국소 평면 제어를 통해 패턴화된 나노바 어레이에 연속 지질 이중층을 형성하여 막 곡률 생성에서 높은 처리량과 더 나은 정확도를 모두 제공합니다. 곡면막에 대한 지질 유동성과 단백질 민감도는 형광 현미경 이미징을 사용하여 정량적으로 특성화할 수 있습니다. 여기에서는 나노바 어레이를 포함하는 제작된 유리 표면에 SLB를 형성하는 방법과 이러한 SLB 상의 곡률 민감성 단백질의 특성 분석에 대한 자세한 절차를 소개합니다. 또한 나노 칩 재사용 및 이미지 처리를위한 프로토콜을 다룹니다. nanobar-SLB 외에도 이 프로토콜은 곡률 감지 연구를 위한 모든 유형의 나노 구조 유리 칩에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Introduction
막 곡률은 형태 형성, 세포 분열 및 세포 이동과 같은 다양한 세포 과정에서 발생하는 세포의 중요한 물리적 매개 변수입니다1. 막 곡률이 세포 사건의 단순한 결과를 넘어선다는 것이 이제 널리 인식되고 있습니다. 대신, 단백질 상호 작용 및 세포 내 신호 전달의 효과적인 조절자로 부상했습니다. 예를 들어, 클라 트린 매개 세포 내 이입에 관여하는 여러 단백질이 곡선 막에 우선적으로 결합하여 세포 내 이입2에 대한 핫스팟을 형성하는 것으로 나타났습니다. 세포골격력에 의한 막 당김, 크기가 다른 머리 그룹을 가진 지질 비대칭의 존재, 원뿔 모양의 막 횡단 단백질의 존재, BAR 도메인 단백질(Bin, amphiphysin 및 Rvs 단백질의 이름을 따서 명명됨)과 같은 막 형성 단백질의 축적, 양친매성 나선 도메인을 막1에 삽입하는 것과 같은 막 변형의 다양한 원인이 있습니다. . 흥미롭게도 이러한 단백질과 지질은 막을 변형시킬 뿐만 아니라 막 곡률을 감지하고 우선적인 축적을 나타낼 수있습니다1. 따라서 곡률이 다른 막이 단백질과 지질의 분포와 역학을 변화시키고 관련 세포 내 과정에 대한 잠재적 영향을 변화시키는지 여부와 방법을 연구하는 것이 중요합니다.
살아있는 세포와 시험관 내 시스템 모두에서 곡선 막과 단백질 간의 상호 작용을 분석하기 위해 많은 기술이 개발되었습니다. 살아있는 세포 시스템은 풍부한 지질 다양성과 동적 단백질 신호 조절 2,3,4,5,6,7을 갖춘 실제 세포 환경을 제공합니다. 그러나, 이러한 정교한 시스템은 세포 내 환경의 불확실성 및 변동으로 인해 연구하기가 어렵다. 따라서 알려진 지질 종과 정제된 단백질로 구성된 인공 막을 사용하는 시험관 내 분석은 단백질과 곡선 막 사이의 관계를 특성화하는 강력한 재구성 시스템이 되었습니다. 전통적으로, 다양한 직경의 리포좀은 원심력을 이용한 공동 침강 분석 또는 단백질 응집을 피하기 위한 밀도 구배를 갖는 공동 부유 분석 8,9를 통해 곡률에 민감한 단백질을 검출하기 위해 압출에 의해 생성됩니다. 그러나, 압출된 리포좀의 곡률은 압출기(10)에 사용되는 멤브레인 필터의 사용 가능한 기공 크기에 의해 제한된다. 단일 리포좀 곡률(SLiC) 분석은 이러한 한계를 극복하는 것으로 입증되었으며, 여기서 직경이 다른 리포좀은 형광 표지되고 표면에 고정화되어 곡률이 형광 강도(11)로 표시될 수 있습니다. 그러나, 지질 조성에서의 강한 가변성이 작은 소포에서 관찰되었고, 이는 곡률 측정의 정확도에 영향을 미친다(12). 테더-풀링 실험은 광학 핀셋을 사용하여 거대한 단층 소포(GUV)로부터 당겨진 과도 테더 상의 곡률의 보다 정확한 측정을 제공하며, 여기서 곡률은 생성된 막 장력에 의해 잘 제어될 수 있다(13,14). 이 방법은 포지티브 또는 네거티브 곡률 감지 단백질을 연구하는 데 적합하지만 튜브 생성10의 처리량에 의해 제한됩니다. 지원되는 멤브레인 튜브(SMrT) 분석은 미세유체 흐름에 의해 동일한 지질 저장소에서 압출되는 여러 멤브레인 튜브를 동시에 생성할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 막 곡률은 나노튜브를 따라 본질적으로 변하며, 이는 형광-강도-기반 곡률 측정(15,16)의 정확도를 손상시킨다. 이에 비해, 작은 단층 소포 (SUVs, 직경 <100 nm17)를 사용하여 설계된 지형을 포함하는 표면 상에 지지된 지질 이중층 (SLB)을 형성하여 나노 제조 또는 나노 물질에 의해 미리 결정된 곡률을 갖는 단일 이중층 막을 높은 정확도로 생성하였다18,19,20.
여기에서는 나노바 어레이가 있는 제작된 나노칩 표면에 SLB를 형성하기 위한 프로토콜과 이를 사용하여 시험관 내 단백질의 곡률 감도를 조사하는 방법을 제시합니다. 도 1에 도시된 바와 같이, 분석의 6가지 필수 성분이 있다: A) 칩을 마이크로유체 챔버로 세척 및 조립하는 단계; B) 정의된 지질 조성을 갖는 SUV의 제조; c) 나노칩 상에 SLB를 형성하고 곡률 민감성 단백질과 결합하는 단계; D) 형광 현미경 하에서 SLB 및 곡률 민감성 단백질의 이미징 및 특성화; E) 재사용을 위해 칩을 청소하는 단계; F) 단백질 곡률 센싱 능력의 정량 분석을 위한 영상 처리. 자세한 프로토콜은 아래에 단계별로 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 나노바-SLB 시스템은 기존의 여러 시험관 분석에서 장점의 고유한 조합을 제공합니다. 리포솜 부유 또는 침강 분석과 같이 고도로 구부러진 막에 대한 단백질의 우선적 결합을 효율적으로 나타내지만 훨씬 적은 수의 샘플이 필요하며 개별 나노바 8,29에서 보다 정확하게 정의된 곡률을 제공합니다. 또한 SLiC 분석법과 동시 비교를 위…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
나노 구조 제조 및 SEM 이미징을 지원하는 난양 기술 대학교 (NTU)의 난양 나노 제조 센터 (N2FC)와 파괴 광자 기술 센터 (CDPT), 단백질 정제를위한 생명 과학 학교 NTU의 단백질 생산 플랫폼 (PPP), 컨포칼 현미경을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU에 감사드립니다. 이 연구는 싱가포르 교육부(MOE)(W. Zhao, RG112/20, RG95/21 및 MOE-T2EP30220-0009), 디지털 분자 분석 및 과학 연구소(IDMxS)가 자금을 지원합니다. 우수 연구 센터 제도(W. Zhao), 휴먼 프론티어 과학 프로그램 재단(W. Zhao, RGY0088/2021), NTU 스타트업 보조금(W. Zhao), 연구 장학금을위한 화학 및 생물 의학 공학 학교 NTU (X. Miao), 연구 장학금을위한 중국 장학금위원회 (J. Wu).
Materials
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
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