JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Published: November 30, 2022
doi:
10.3791/64340
, ,
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology,Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science,Nanyang Technological University

Summary

Hier wird ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem entwickelt, um eine synthetische Membran mit einer definierten Krümmung bereitzustellen, die die Charakterisierung von Proteinen mit Krümmungssensorik in vitro ermöglicht.

Abstract

Die Membrankrümmung spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen essentiellen Prozessen von Zellen, wie Zellmigration, Zellteilung und Vesikeltransport. Es wird nicht nur passiv durch zelluläre Aktivitäten erzeugt, sondern reguliert auch aktiv Proteininteraktionen und ist an vielen intrazellulären Signalen beteiligt. Daher ist es von großem Wert, die Rolle der Membrankrümmung bei der Regulierung der Verteilung und Dynamik von Proteinen und Lipiden zu untersuchen. In jüngster Zeit wurden viele Techniken entwickelt, um die Beziehung zwischen der gekrümmten Membran und dem Protein in vitro zu untersuchen. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken bietet die neu entwickelte nanobar-gestützte Lipiddoppelschicht (SLB) sowohl einen hohen Durchsatz als auch eine bessere Genauigkeit bei der Erzeugung von Membrankrümmungen, indem sie eine kontinuierliche Lipiddoppelschicht auf strukturierten Arrays von Nanobarren mit einer vordefinierten Membrankrümmung und lokaler flacher Kontrolle bildet. Sowohl die Lipidfluidität als auch die Proteinempfindlichkeit gegenüber gekrümmten Membranen können mittels fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung quantitativ charakterisiert werden. Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Bildung eines SLB auf hergestellten Glasoberflächen mit Nanobar-Arrays und zur Charakterisierung krümmungsempfindlicher Proteine auf solchen SLB vorgestellt. Darüber hinaus werden Protokolle für die Wiederverwendung von Nanochips und die Bildverarbeitung behandelt. Über den Nanobar-SLB hinaus ist dieses Protokoll leicht auf alle Arten von nanostrukturierten Glaschips für Krümmungsstudien anwendbar.

Introduction

Die Membrankrümmung ist ein kritischer physikalischer Parameter einer Zelle, der bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Morphogenese, Zellteilung und Zellmigration auftritt1. Es ist heute allgemein anerkannt, dass die Membrankrümmung über ein einfaches Ergebnis zellulärer Ereignisse hinausgeht; Stattdessen hat es sich als wirksamer Regulator von Proteininteraktionen und intrazellulären Signalen herausgestellt. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass mehrere Proteine, die an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sind, bevorzugt an die gekrümmte Membran binden, was zur Bildung eines Hotspots für Endozytose2 führt. Es gibt viele verschiedene Ursachen für die Membranverformung wie das Ziehen der Membran durch die Zytoskelettkräfte, das Vorhandensein von Lipidasymmetrie mit unterschiedlich großen Kopfgruppen, das Vorhandensein von Transmembranproteinen mit konischer Form, die Akkumulation von membranformenden Proteinen wie BAR-Domänenproteinen (benannt nach Bin-, Amphiphysin- und Rvs-Proteinen) und das Einfügen amphipathischer Helices-Domäne in die Membran1 . Interessanterweise verformen diese Proteine und Lipide nicht nur die Membran, sondern können auch die Membrankrümmung wahrnehmen und eine bevorzugte Akkumulation aufweisen1. Daher ist es entscheidend zu untersuchen, ob und wie Membranen mit unterschiedlichen Krümmungen die Verteilung und Dynamik der an sie gebundenen Proteine und Lipide verändern und welche Auswirkungen dies auf die damit verbundenen intrazellulären Prozesse haben kann.

Viele Techniken wurden entwickelt, um die Interaktion zwischen gekrümmter Membran und Proteinen sowohl in lebenden Zell- als auch in In-vitro-Systemen zu analysieren. Das Lebendzellsystem bietet eine reale Zellumgebung mit reicher Lipiddiversität und dynamischer Proteinsignalregulation 2,3,4,5,6,7. Ein solch ausgeklügeltes System ist jedoch aufgrund der Unsicherheiten und Schwankungen in der intrazellulären Umgebung schwer zu untersuchen. Daher sind die In-vitro-Assays mit einer künstlichen Membran, die aus bekannten Lipidspezies und gereinigten Proteinen besteht, zu leistungsfähigen Rekonstitutionssystemen geworden, um die Beziehung zwischen Proteinen und gekrümmten Membranen zu charakterisieren. Herkömmlicherweise werden Liposomen unterschiedlicher Durchmesser durch Extrusion erzeugt, um krümmungsempfindliche Proteine entweder über einen Co-Sedimentationsassay mit Zentrifugalkraft oder einen Coflotationsassay mit einem Dichtegradienten zu detektieren, um eine Proteinaggregation zu vermeiden 8,9. Die Krümmung der extrudierten Liposomen ist jedoch durch die verfügbare Porengröße des im Extruder10 verwendeten Membranfilters begrenzt. Es wurde nachgewiesen, dass der Single Liposome Curvature (SLiC) Assay diese Einschränkung überwindet, bei der Liposomen mit unterschiedlichen Durchmessern fluoreszenzmarkiert und auf der Oberfläche immobilisiert werden, so dass die Krümmung durch die Fluoreszenzintensität markiert werden kann11. Es wurde jedoch eine starke Variabilität der Lipidzusammensetzung in kleinen Vesikeln beobachtet, was die Genauigkeit der Krümmungsmessung beeinflusst12. Tether-Pulling-Experimente liefern eine genauere Messung der Krümmung des transienten Seils, das von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) gezogen wird, mit einer optischen Pinzette, bei der die Krümmung durch die erzeugte Membranspannung gut gesteuert werden kann13,14. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung von Proteinen mit positiver oder negativer Krümmung, ist jedoch durch den Durchsatz der Röhrchenerzeugung10 eingeschränkt. Der SMrT-Assay (Supported Membrane Tubes) ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung mehrerer Membranröhren, die durch mikrofluidische Strömungen aus demselben Lipidreservoir extrudiert werden. Dennoch variiert die Membrankrümmung intrinsisch entlang der Nanoröhre, was die Genauigkeit der fluoreszenzintensitätsbasierten Krümmungsmessungbeeinträchtigt 15,16. Im Vergleich dazu erzeugte die Verwendung kleiner unilamellärer Vesikel (SUVs, Durchmesser <100 nm17) zur Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) auf Oberflächen, die entworfene Topographien enthielten, eine einzelne Doppelschichtmembran mit Krümmungen, die durch Nanofabrikation oder Nanomaterialien in hoher Genauigkeit vorbestimmtwaren 18,19,20.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Bildung des SLB auf hergestellten Nanochip-Oberflächen mit Nanobar-Arrays vor und wie damit die Krümmungsempfindlichkeit von Proteinen in vitro untersucht werden kann. Wie in Abbildung 1 gezeigt, gibt es sechs wesentliche Komponenten des Assays: A) Reinigung und Montage des Chips mit einer mikrofluidischen Kammer; B) Herstellung von SUVs mit definierter Lipidzusammensetzung; C) Bildung des SLB auf einem Nanochip und Bindung an krümmungsempfindliche Proteine; D) Bildgebung und Charakterisierung der SLB- und krümmungsempfindlichen Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie; E) Reinigung des Chips zur Wiederverwendung; F) Bildverarbeitung zur quantitativen Analyse der Proteinkrümmungsfähigkeit. Das detaillierte Protokoll wird im Folgenden Schritt für Schritt beschrieben.

Protocol

1. Reinigung des Nanochips Legen Sie den Nanochip mit der gemusterten Seite nach oben in ein 10-ml-Becherglas.HINWEIS: Dieser Quarz-Nanochip wurde mittels Elektronenstrahllithographie hergestellt, wie zuvorbeschrieben 21. Die Geometrie und Anordnung der Nanostruktur auf dem Chip kann kundenspezifisch gestaltet werden. Die Größen der hier verwendeten Gradienten-Nanobarren betragen 2000 nm Länge, 600 nm Höhe und 100 bis 1000 nm Breite (100 nm Step-Set).</l…

Representative Results

Das Nanobar-Design wird für die Untersuchung positiver Krümmungssensorproteine empfohlen, die an jedem Ende einen Halbkreis mit einer Krümmung enthalten, die durch die Nanobarbreite definiert ist, und eine flache / Nullkrümmungskontrolle lokal in der Mitte (Abbildung 2A, B). Die erfolgreiche Bildung des SLB auf Nanobarren führt zu gleichmäßig verteilten Lipidmarkersignalen über die gesamte Nanobar-Oberfläche, wie in Abbildung 2C gezeigt…

Discussion

Das hier beschriebene Nanobar-SLB-System bietet eine einzigartige Kombination der Vorteile in mehreren bestehenden in vitro Assays. Es zeigt effizient die bevorzugte Bindung von Proteinen an stark gekrümmte Membranen als Liposomenfloatations- oder Sedimentationsassay, benötigt jedoch viel weniger Proben und bietet eine genauer definierte Krümmung auf einzelnen Nanobars 8,29. Es bietet auch eine breite Palette von präzise kontrollierten Krümmungen f?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) und dem Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) an der Nanyang Technological University (NTU) für die Unterstützung der Nanostrukturherstellung und der REM-Bildgebung, der Protein Production Platform (PPP) an der School of Biological Sciences NTU für die Proteinreinigung und der School of Chemical and Biomedical Engineering NTU für das konfokale Mikroskop. Diese Arbeit wird finanziert durch das singapurische Bildungsministerium (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 und MOE-T2EP30220-0009), das Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS), unterstützt durch MOE-Mittel im Rahmen des Research Centres of Excellence-Programms (W. Zhao), die Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), den NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU für das Forschungsstipendium (X. Miao) und China Scholarship Council für das Forschungsstipendium (J. Wu).

Materials

Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Tags

Nanobar-supported Lipid BilayerMembrane Curvature SensingProtein DynamicsNanofabricationPiranha SolutionLipid MixtureSUVsPDMS Chamber
check_url/fr/64340?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image