JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Ett nanobar-stött lipid-dubbelskiktssystem för studier av membrankrökningsavkännande proteiner in vitro

Published: November 30, 2022
doi:
10.3791/64340
, ,
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology,Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science,Nanyang Technological University

Summary

Här utvecklas ett nanobarstödt lipid-dubbelskiktssystem för att tillhandahålla ett syntetiskt membran med en definierad krökning som möjliggör karakterisering av proteiner med krökningsavkänningsförmåga in vitro.

Abstract

Membrankrökning spelar viktiga roller i olika väsentliga processer av celler, såsom cellmigration, celldelning och vesikelhandel. Det genereras inte bara passivt av cellulära aktiviteter, utan reglerar också aktivt proteininteraktioner och är involverat i många intracellulära signaleringar. Således är det av stort värde att undersöka membrankrökningens roll för att reglera fördelningen och dynamiken hos proteiner och lipider. Nyligen har många tekniker utvecklats för att studera förhållandet mellan det krökta membranet och proteinet in vitro. Jämfört med traditionella tekniker erbjuder det nyutvecklade nanobarstödda lipid-dubbelskiktet (SLB) både hög genomströmning och bättre noggrannhet i membrankrökningsgenerering genom att bilda ett kontinuerligt lipid-dubbelskikt på mönstrade arrays av nanobarer med en fördefinierad membrankrökning och lokal platt kontroll. Både lipidfluiditeten och proteinkänsligheten för krökta membran kan karakteriseras kvantitativt med hjälp av fluorescensmikroskopiavbildning. Här introduceras en detaljerad procedur för hur man bildar en SLB på tillverkade glasytor som innehåller nanobarmatriser och karakteriseringen av krökningskänsliga proteiner på sådan SLB. Dessutom omfattas protokoll för återanvändning av nanochip och bildbehandling. Utöver nanobar-SLB är detta protokoll lätt tillämpligt på alla typer av nanostrukturerade glasflisor för krökningsavkänningsstudier.

Introduction

Membrankrökning är en kritisk fysisk parameter för en cell som förekommer i en mängd olika cellulära processer såsom morfogenes, celldelning och cellmigration1. Det är allmänt erkänt nu att membrankrökningen är bortom ett enkelt resultat av cellulära händelser; Istället har det framstått som en effektiv regulator för proteininteraktioner och intracellulär signalering. Till exempel visade sig flera proteiner som är involverade i clathrinmedierad endocytos företrädesvis binda till det krökta membranet, vilket resulterade i bildandet av en hotspot för endocytos2. Det finns många olika orsaker till membrandeformation såsom membrandragning av cytoskelettkrafterna, närvaron av lipidasymmetri med olika stora huvudgrupper, förekomsten av transmembranproteiner med konisk form, ackumulering av membranformande proteiner som BAR-domänproteiner (uppkallad efter Bin-, amfifysin- och Rvs-proteiner) och införandet av amfipatiska helicesdomän i membranet1 . Intressant nog deformerar dessa proteiner och lipider inte bara membranet utan kan också känna av membrankrökningen och uppvisa preferensackumulering1. Därför är det viktigt att studera om och hur membran med olika krökningar förändrar fördelningen och dynamiken hos proteiner och lipider som är fästa vid dem och de potentiella effekterna på de relaterade intracellulära processerna.

Många tekniker har utvecklats för att analysera interaktionen mellan krökt membran och proteiner i både levande celler och in vitro-system. Det levande cellsystemet ger en verklig cellmiljö med rik lipiddiversitet och dynamisk proteinsignalreglering 2,3,4,5,6,7. Ett sådant sofistikerat system är emellertid svårt att studera på grund av osäkerheter och fluktuationer i den intracellulära miljön. Därför har in vitro-analyserna med hjälp av ett artificiellt membran bestående av kända lipidarter och renade proteiner blivit kraftfulla rekonstitueringssystem för att karakterisera förhållandet mellan proteiner och krökta membran. Traditionellt genereras liposomer med olika diametrar genom extrudering för att detektera krökningskänsliga proteiner via antingen en samsedimenteringsanalys med användning av centrifugalkraft eller en samflotationsanalys med en densitetsgradient för att undvika proteinaggregering 8,9. Krökningen hos de extruderade liposomerna begränsas emellertid av den tillgängliga porstorleken hos membranfiltret som används i extrudern10. SLiC-analys (Single liposome curvatur) har visat sig övervinna denna begränsning, där liposomer med olika diametrar fluorescensmärks och immobiliseras på ytan så att krökningen kan markeras av den fluorescerande intensiteten11. Emellertid har stark variation i lipidkompositionen observerats i små vesiklar, vilket påverkar noggrannheten hos krökningsmätningen12. Tether-pulling-experiment ger en mer exakt mätning av krökningen på den övergående tjudern som dras från gigantiska unilamellära vesiklar (GUV) med hjälp av en optisk pincett, där krökningen kan kontrolleras väl av membranspänningen som genereras13,14. Denna metod är lämplig för att studera antingen positiva eller negativa krökningsavkänningsproteiner, men begränsas av genomströmningen av rörgenerering10. SMrT-analys (Supported Membrane Tubes) ger samtidig generering av flera membranrör som strängsprutas från samma lipidreservoar genom mikrofluidiska flöden. Ändå varierar membrankrökningen i sig längs nanoröret, vilket äventyrar noggrannheten hos fluorescensintensitetsbaserad krökningsmätning15,16. Som jämförelse genererade användning av små unilamellära vesiklar (SUV, diameter <100 nm17) för att bilda ett stödd lipid-dubbelskikt (SLB) på ytor som innehåller designade topografier ett enda dubbelskiktsmembran med krökningar förutbestämda av nanofabrikation eller nanomaterial med hög noggrannhet18,19,20.

Här presenterar vi ett protokoll för bildandet av SLB på tillverkade nanochipytor med nanobarmatriser och hur det kan användas för att undersöka krökningskänsligheten hos proteiner in vitro. Som visas i figur 1 finns det sex väsentliga komponenter i analysen: A) Rengöring och montering av chipet med en mikrofluidisk kammare; B) Framställning av stadsjeepar med definierad lipidsammansättning; C) Bildning av SLB på ett nanochip och bindning med krökningskänsliga proteiner; D) Avbildning och karakterisering av SLB- och krökningskänsliga proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengöring av chipet för återanvändning; F) Bildbehandling för kvantitativ analys av proteinkrökningsavkänningsförmåga. Det detaljerade protokollet beskrivs steg för steg nedan.

Protocol

1. Rengöring av nanochip Placera nanochipet i en 10 ml bägare med den mönstrade sidan uppåt.OBS: Detta kvartsnanochip har tillverkats via elektronstrålelitografi som beskrivits före21. Geometrin och arrangemanget av nanostrukturen på chipet kan specialdesignas. Storleken på de gradientnanobarer som används här är 2000 nm långa, 600 nm höga och 100 till 1000 nm breda (100 nm steguppsättning). Tillsätt försiktigt 1 ml 98% svavelsyra t…

Representative Results

Nanobar-design rekommenderas för att undersöka proteiner med positiv krökningsavkänning, som innehåller en halvcirkel i varje ände med krökning definierad av nanobarbredden och en platt/noll krökningskontroll lokalt i mitten (figur 2A,B). Framgångsrik bildning av SLB på nanobarer resulterar i jämnt fördelade lipidmarkörsignaler över hela nanobarytan som visas i figur 2C. Signaler från flera nanobarer kan kombineras genom att medel…

Discussion

Nanobar-SLB-systemet som beskrivs här erbjuder en unik kombination av fördelarna i flera befintliga in vitro-analyser. Det avslöjar effektivt den föredragna bindningen av proteiner till mycket krökta membran som liposomflytning eller sedimenteringsanalys men kräver mycket färre prover och erbjuder mer exakt definierad krökning på enskilda nanobarer 8,29. Det erbjuder också ett brett utbud av exakt kontrollerad krökning för samtidig jämförel…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) och Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) vid Nanyang Technological University (NTU) för att stödja nanostrukturtillverkning och SEM-avbildning, Protein Production Platform (PPP) vid School of Biological Sciences NTU för proteinrening och School of Chemical and Biomedical Engineering NTU för konfokalmikroskopet. Detta arbete finansieras av Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 och MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) som stöds av MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-systemet (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), Skolan för kemisk och biomedicinsk teknik NTU för forskningsstipendiet (X. Miao) och China Scholarship Council för forskningsstipendiet (J. Wu).

Materials

Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Tags

Nanobar-supported Lipid BilayerMembrane Curvature SensingProtein DynamicsNanofabricationPiranha SolutionLipid MixtureSUVsPDMS Chamber
check_url/fr/64340?article_type=t&slug=a-nanobar-supported-lipid-bilayer-system-for-study-membrane-curvature

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image