JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biochimie

Um Sistema de Bicamada Lipídica Suportado por Nanobar para o Estudo de Proteínas de Detecção de Curvatura de Membrana in vitro

Published: November 30, 2022
doi:
10.3791/64340
, ,
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology,Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science,Nanyang Technological University

Summary

Aqui, um sistema de bicamada lipídica suportado por nanobar é desenvolvido para fornecer uma membrana sintética com uma curvatura definida que permite a caracterização de proteínas com capacidade de detecção de curvatura in vitro.

Abstract

A curvatura da membrana desempenha papéis importantes em vários processos essenciais das células, como migração celular, divisão celular e tráfico de vesículas. Não é apenas gerado passivamente por atividades celulares, mas também regula ativamente as interações proteicas e está envolvido em muitas sinalizações intracelulares. Assim, é de grande valor examinar o papel da curvatura da membrana na regulação da distribuição e dinâmica de proteínas e lipídios. Recentemente, muitas técnicas foram desenvolvidas para estudar a relação entre a membrana curva e a proteína in vitro. Em comparação com as técnicas tradicionais, a recém-desenvolvida bicamada lipídica suportada por nanobarras (SLB) oferece alto rendimento e melhor precisão na geração de curvatura de membrana, formando uma bicamada lipídica contínua em matrizes padronizadas de nanobarras com uma curvatura de membrana pré-definida e controle plano local. Tanto a fluidez lipídica quanto a sensibilidade proteica a membranas curvas podem ser quantitativamente caracterizadas usando microscopia de fluorescência. Aqui, um procedimento detalhado sobre como formar um SLB em superfícies de vidro fabricadas contendo matrizes de nanobarras e a caracterização de proteínas sensíveis à curvatura em tal SLB são introduzidos. Além disso, os protocolos para reutilização de nanochips e processamento de imagens são cobertos. Além do nanobar-SLB, este protocolo é prontamente aplicável a todos os tipos de chips de vidro nanoestruturados para estudos de detecção de curvatura.

Introduction

A curvatura da membrana é um parâmetro físico crítico de uma célula que ocorre em uma variedade de processos celulares, como morfogênese, divisão celular e migração celular1. É amplamente reconhecido agora que a curvatura da membrana está além de um simples resultado de eventos celulares; em vez disso, emergiu como um regulador eficaz das interações proteicas e da sinalização intracelular. Por exemplo, várias proteínas envolvidas na endocitose mediada por clatrina se ligam preferencialmente à membrana curva, resultando na formação de um hotspot para endocitose2. Existem muitas causas diferentes de deformação da membrana, como a tração da membrana pelas forças do citoesqueleto, a presença de assimetria lipídica com grupos de cabeça de diferentes tamanhos, a existência de proteínas transmembranares com forma cônica, o acúmulo de proteínas modeladoras de membrana, como proteínas do domínio BAR (nomeadas após as proteínas Bin, anfifisina e Rvs) e a inserção do domínio das hélices anfipáticas na membrana1 . Curiosamente, essas proteínas e lipídios não apenas deformam a membrana, mas também podem sentir a curvatura da membrana e exibir acúmulo preferencial1. Portanto, é crucial estudar se e como membranas com diferentes curvaturas alteram a distribuição e a dinâmica de proteínas e lipídios ligados a elas e os impactos potenciais nos processos intracelulares relacionados.

Muitas técnicas foram desenvolvidas para analisar a interação entre membrana curva e proteínas em sistemas celulares vivos e in vitro. O sistema celular vivo proporciona um ambiente celular real com rica diversidade lipídica e regulação dinâmica da sinalização proteica 2,3,4,5,6,7. No entanto, um sistema tão sofisticado é difícil de estudar devido às incertezas e flutuações no ambiente intracelular. Assim, os ensaios in vitro utilizando uma membrana artificial composta por espécies lipídicas conhecidas e proteínas purificadas tornaram-se poderosos sistemas de reconstituição para caracterizar a relação entre proteínas e membranas curvas. Tradicionalmente, lipossomas de diferentes diâmetros são gerados por extrusão para detectar proteínas sensíveis à curvatura por meio de um ensaio de co-sedimentação usando força centrífuga ou um ensaio de co-flotação com um gradiente de densidade para evitar a agregação de proteínas 8,9. No entanto, a curvatura dos lipossomas extrudados é limitada pelo tamanho dos poros disponíveis do filtro de membrana utilizado na extrusora10. Está comprovado que o ensaio de curvatura de lipossomo único (SLiC) supera essa limitação, no qual lipossomas com diferentes diâmetros são marcados com fluorescência e imobilizados na superfície para que a curvatura possa ser marcada pela intensidade fluorescente11. Entretanto, tem sido observada forte variabilidade na composição lipídica em pequenas vesículas, o que afeta a acurácia da medida da curvatura12. Experimentos de puxar amarração fornecem uma medida mais precisa da curvatura na corda transitória puxada de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) usando um tweezer óptico, onde a curvatura pode ser bem controlada pela tensão da membrana gerada13,14. Este método é adequado para estudar proteínas de detecção de curvatura positiva ou negativa, mas é limitado pelo rendimento da geração de tubos10. O ensaio de tubos de membrana suportados (SMrT) permite a geração simultânea de múltiplos tubos de membrana que são extrudados do mesmo reservatório lipídico por fluxos microfluídicos. No entanto, a curvatura da membrana varia intrinsecamente ao longo do nanotubo, o que compromete a precisão da medida da curvatura baseada na intensidade de fluorescência15,16. Em comparação, a utilização de pequenas vesículas unilamelares (SUVs, diâmetro <100 nm17) para formar uma bicamada lipídica suportada (SLB) em superfícies contendo topografias projetadas gerou uma única membrana bicamada com curvaturas predeterminadas por nanofabricação ou nanomateriais em alta precisão18,19,20.

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação do SLB em superfícies de nanochips fabricadas com matrizes de nanobarras e como ele pode ser usado para sondar a sensibilidade à curvatura de proteínas in vitro. Como mostra a Figura 1, existem seis componentes essenciais do ensaio: A) Limpeza e montagem do chip com câmara microfluídica; B) Preparação de SUVs com composição lipídica definida; C) Formação do SLB em nanochip e ligação com proteínas sensíveis à curvatura; D) Imagem e caracterização do SLB e proteínas sensíveis à curvatura sob microscopia de fluorescência; E) Limpeza do chip para reutilização; F) Processamento de imagens para análise quantitativa da capacidade de detecção da curvatura de proteínas. O protocolo detalhado é descrito passo a passo abaixo.

Protocol

1. Limpeza de nanochip Coloque o nanochip em um copo de 10 mL com o lado padronizado voltado para cima.NOTA: Este nanochip de quartzo foi fabricado através de litografia por feixe de elétrons, conforme descrito antesdo 21. A geometria e o arranjo da nanoestrutura no chip podem ser projetados sob medida. Os tamanhos das nanobarras de gradiente usadas aqui são de 2000 nm de comprimento, 600 nm de altura e 100 a 1000 nm de largura (conjunto de degraus de 100…

Representative Results

O projeto de nanobar é recomendado para sondar proteínas de detecção de curvatura positiva, que contém um meio círculo em cada extremidade com curvatura definida pela largura da nanobarra e um controle de curvatura plana/zero localmente no centro (Figura 2A,B). A formação bem-sucedida do SLB em nanobarras resulta em sinais de marcadores lipídicos distribuídos uniformemente em toda a superfície do nanobar, como mostrado na Figura 2C. O…

Discussion

O sistema nanobar-SLB descrito aqui oferece uma combinação única das vantagens em vários ensaios in vitro existentes. Revela eficientemente a ligação preferencial de proteínas a membranas altamente curvas como o ensaio de flutuação ou sedimentação de lipossomas, mas requer muito menos amostras e oferece curvatura mais precisamente definida em nanobarras individuais 8,29. Ele também oferece uma ampla gama de curvatura precisamente controlada p…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) e ao Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) da Nanyang Technological University (NTU) por apoiar a fabricação de nanoestruturas e imagens MEV, a Plataforma de Produção de Proteínas (PPP) da Escola de Ciências Biológicas da NTU para purificação de proteínas e a Escola de Engenharia Química e Biomédica NTU para o microscópio confocal. Este trabalho é financiado pelo Ministério da Educação de Singapura (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 e MOE-T2EP30220-0009), pelo Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) apoiado pelo financiamento do MOE ao abrigo do esquema Research Centres of Excellence (W. Zhao), pela Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), pela NTU Start-up Grant (W. Zhao), Escola de Engenharia Química e Biomédica NTU para a bolsa de pesquisa (X. Miao), e Conselho de Bolsas de Estudo da China para a bolsa de pesquisa (J. Wu).

Materials

Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Tags

Nanobar-supported Lipid BilayerMembrane Curvature SensingProtein DynamicsNanofabricationPiranha SolutionLipid MixtureSUVsPDMS Chamber
check_url/fr/64340?article_type=t&slug=a-nanobar-supported-lipid-bilayer-system-for-study-membrane-curvature

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image