Компостные микрокосмы приносят микробное разнообразие, обнаруженное в природе, в лабораторию, чтобы облегчить исследования микробиома у Caenorhabditis elegans. Здесь представлены протоколы для проведения экспериментов с микрокосмом, причем эксперименты демонстрируют способность модулировать микробное разнообразие окружающей среды для изучения взаимосвязей между микробным разнообразием окружающей среды и составом микробиома кишечника червей.
Нематода Caenorhabditis elegans становится полезной моделью для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействий между хозяевами и их кишечными микробиомами. В то время как эксперименты с хорошо охарактеризованными бактериями или определенными бактериальными сообществами могут облегчить анализ молекулярных механизмов, изучение нематод в их естественном микробном контексте имеет важное значение для изучения разнообразия таких механизмов. В то же время выделение червей из дикой природы не всегда осуществимо, и, даже когда это возможно, отбор проб из дикой природы ограничивает использование генетического инструментария, доступного в противном случае для исследований C. elegans . Следующий протокол описывает метод исследований микробиома с использованием компостных микрокосм для роста в лаборатории в микробно разнообразных и естественных средах.
Почва из местных источников может быть обогащена продуктами для диверсификации микробных сообществ, в которых выращиваются черви и из которых они собираются, моются и стерилизуются для последующего анализа. Репрезентативные эксперименты демонстрируют способность модулировать микробное сообщество в общей почве, обогащая его различными продуктами, и дополнительно демонстрируют, что черви, выращенные в этих различных средах, собирают аналогичные кишечные микробиомы, отличные от их соответствующих сред, поддерживая идею видоспецифического основного кишечного микробиома. В целом, компостные микрокосмы обеспечивают естественную лабораторную среду для исследований микробиома в качестве альтернативы синтетическим микробным сообществам или изоляции диких нематод.
Нематода Caenorhabditis elegans становится полезной моделью для изучения взаимодействий между хозяевами и их кишечными микробиомами 1,2. Как модель, он предлагает несколько преимуществ. Во-первых, животные, свободные от микробов или гнотобиотические животные, легко получить и содержать; отбеливатель может быть использован для уничтожения гравидных червей и связанных с ними микробов, оставляя их устойчивые к отбеливанию яйца невредимыми для роста в качестве синхронизированных по возрасту популяций, которые могут быть колонизированы бактериями, представляющими интерес 3,4. Кроме того, при выращивании в присутствии бактерий C. elegans, бактеривора, проглатывает встречающиеся бактерии, при этом восприимчивые виды перевариваются или выводятся, в то время как устойчивые и стойкие виды стабильно колонизируют кишечник червя. Кроме того, C. elegans в основном гермафродитны, производя популяции генетически идентичного потомства, что уменьшает смешение генетических вариаций. В сочетании с наличием мутантных и трансгенных штаммов червей, работа с C. elegans предлагает исследователям гнотобиотическую и генетически поддающуюся обработке модель для исследования молекулярных основ взаимодействий хозяин-микроб 5,6,7,8.
В то время как эксперименты с хорошо охарактеризованными бактериями могут облегчить анализ молекулярных механизмов, выявление и изучение бактерий, с которыми черви взаимодействуют в природе, имеет важное значение для изучения разнообразия таких механизмов, разгадки естественного контекста для их функции и понимания селективных сил, которые сформировали их эволюцию. За пределами лаборатории C. elegans встречается во всем мире во влажном умеренном климате, где, как полагают, популяции подвергаются жизненному циклу «бума и спада», характеризующемуся быстрым ростом населения, когда ресурсы в изобилии, с последующим переходом развития к новаторским, стрессоустойчивым дауэрам, когда ресурсы истощаются9. Несмотря на то, что популяции C. elegans считаются почвенной нематодой, размножающиеся в дикой природе, чаще всего питаются разлагающимся органическим материалом, таким как гниющие цветы или фрукты, где бактериальные популяции многочисленны и разнообразны.
Исследования кишечного микробиома у нематод, выделенных из дикой природы, выявили разнообразные, но характерные бактериальные сообщества10,11, состав которых был дополнительно подтвержден исследованиями, проведенными с червями, выращенными в естественно-подобных микромировых средах12,13. Вместе такие исследования позволили очертить основной микробиом кишечника червя2. В то время как выборка популяций C. elegans в дикой природе представляет собой наиболее непосредственное исследование естественных взаимодействий червей и микробов, она не осуществима везде и в любое время, поскольку она ограничена регионами и сезонами с достаточным количеством осадков10,11. В качестве альтернативы, вместо выделения червей из их естественной среды обитания, эксперименты с использованием микрокосм приносят естественную среду обитания в лабораторию 6,8,12,13,14,15. Микромировые среды получают из почвы, компостированной различными фруктами или овощами, что позволяет дополнительно диверсифицировать исходное почвенное сообщество. Они предлагают поддающиеся обработке экспериментальные методы, которые сочетают микробное разнообразие и трехмерную дикую почвенную среду с экспериментальными преимуществами контролируемой лабораторной установки и генетически определенных штаммов червей. В приведенном ниже протоколе подробно описываются этапы, связанные с работой с компостными микрокосмами, демонстрируя их использование в понимании сборки характерного микробиома кишечника червя из различных сред.
Представленный здесь протокол описывает метод изучения кишечного микробиома нематод, выращенных в естественно-подобных средах, предлагая альтернативный подход к выделению червей от природы или к их выращиванию на синтетических сообществах.
Тысячи потенциальных видов бактерий, захваченных в эксперименте с репрезентативным микрокосмом, отражают микробное разнообразие, с которым развились черви, и демонстрируют способность конвейера микрокосма сочетать преимущества работы с модельным организмом-хозяином и преимущества работы с естественными, разнообразными микробными сообществами.
Репрезентативные результаты показывают, что обогащение общей почвы различными типами продуктов модулирует экологическое микробное разнообразие, подчеркивая диапазон микробного разнообразия, доступного для разведки с использованием этого трубопровода. Выбор продукции не особенно важен. Предыдущая работа использовала бананы, яблоки, апельсины, клубнику, листья зеленого чая и картофель для обогащения почвы, что привело к повышению эффективности подобных червей. Смешанная продукция также используется эффективно. Ключевая особенность заключается в том, что различные продукты будут диверсифицировать данную почву различными способами.
Несмотря на широкие различия в микробном разнообразии окружающей среды, микробиомы кишечника червей значительно меньше различаются, что подтверждает важность ниши кишечника червя и фильтрации хозяина для сборки основного микробиома кишечника, который отличается от его почвенной среды13. Эта картина лучше всего наблюдается при взвешенном анализе UniFrac PCoA, демонстрирующем, что различия между экологическими почвенными и кишечными микробиомами червей проистекают в основном из различий в относительном изобилии ключевых таксонов.
Хотя протокол, описанный здесь, фокусируется на сборе червей для секвенирования 16S, микрокосмы могут быть использованы для изучения дополнительных вопросов, представляющих интерес. Например, черви, собранные из микрокосм, могут быть впоследствии исследованы на предмет влияния разнообразного кишечного микробиома на устойчивость хозяина к различным неблагоприятным условиям, включая патогены или токсины. В качестве альтернативы, новые виды бактерий и штаммы могут быть выделены и культивированы из наземных червей, расширяя таксономическое и функциональное разнообразие бактерий, доступных для проведения экспериментов.
В то время как методы исследования в лабораторных условиях стремятся к согласованности и воспроизводимости, работа с микрокосмами использует естественные вариации для изучения взаимодействий хозяина и микроба в естественном контексте. Тем не менее, это изменение также создает некоторые проблемы. Некоторые почвы, которые включают высокие уровни эндогенных беспозвоночных, могут потребовать дополнительных этапов центрифугирования, фильтрации и обследования для эффективного устранения нежелательных организмов из препарата микромира. Кроме того, низкое микробное изобилие в почве может вызвать нежелательное образование дауэра в популяциях червей, требуя увеличения микробного экстракта или обогащения почвы большим количеством продукта. С каждым экспериментом с микрокосмом исследователи продолжают изучать полное таксономическое и функциональное разнообразие, обеспечиваемое природой, что позволяет открывать новые микробные таксоны и функциональные способности, начиная от устойчивости к инфекциям до защиты от ксенобиотиков окружающей среды.
The authors have nothing to disclose.
Работа, описанная в этой рукописи, была поддержана грантами NIH R01OD024780 и R01AG061302. K.T. был также поддержан Летней исследовательской стипендией для студентов из Калифорнийского университета в Беркли, финансируемой Фондом Роуз-Хиллз. Мультяшные рисунки на рисунке 1 были получены от BioRender.com.
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |