Les microcosmes de compost apportent la diversité microbienne trouvée dans la nature en laboratoire pour faciliter la recherche sur le microbiome chez Caenorhabditis elegans. Voici des protocoles pour la mise en place d’expériences de microcosme, les expériences démontrant la capacité de moduler la diversité microbienne environnementale pour explorer les relations entre la diversité microbienne environnementale et la composition du microbiome intestinal du ver.
Le nématode Caenorhabditis elegans apparaît comme un modèle utile pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux interactions entre les hôtes et leurs microbiomes intestinaux. Bien que des expériences avec des bactéries bien caractérisées ou des communautés bactériennes définies puissent faciliter l’analyse des mécanismes moléculaires, l’étude des nématodes dans leur contexte microbien naturel est essentielle pour explorer la diversité de ces mécanismes. En même temps, l’isolement des vers de la nature n’est pas toujours possible et, même lorsque cela est possible, l’échantillonnage dans la nature limite l’utilisation de la boîte à outils génétique autrement disponible pour la recherche sur C. elegans. Le protocole suivant décrit une méthode pour les études du microbiome utilisant des microcosmes de compost pour la croissance en laboratoire dans des environnements microbiens divers et naturels.
Le sol d’origine locale peut être enrichi avec des produits pour diversifier les communautés microbiennes dans lesquelles les vers sont élevés et à partir desquels ils sont récoltés, lavés et stérilisés en surface pour des analyses ultérieures. Des expériences représentatives démontrent la capacité de moduler la communauté microbienne dans un sol commun en l’enrichissant avec différents produits et démontrent en outre que les vers élevés dans ces environnements distincts assemblent des microbiomes intestinaux similaires distincts de leurs environnements respectifs, soutenant la notion d’un microbiome intestinal central spécifique à l’espèce. Dans l’ensemble, les microcosmes de compost fournissent des environnements de laboratoire naturels pour la recherche sur le microbiome comme alternative aux communautés microbiennes synthétiques ou à l’isolement des nématodes sauvages.
Le nématode Caenorhabditis elegans apparaît comme un modèle utile pour étudier les interactions entre les hôtes et leur microbiome intestinal 1,2. En tant que modèle, il offre plusieurs avantages. Premièrement, les animaux exempts de germes ou gnotobiotiques sont faciles à obtenir et à entretenir; L’eau de Javel peut être utilisée pour tuer les vers gravides et les microbes associés, laissant leurs œufs résistants à l’eau de Javel sains et saufs pour se développer en tant que populations synchronisées selon l’âge qui peuvent être colonisées par des bactéries d’intérêt 3,4. De plus, lorsqu’il est cultivé en présence de bactéries, C. elegans, un bactériivore, ingère les bactéries rencontrées, les espèces sensibles étant digérées ou excrétées, tandis que les espèces résistantes et persistantes colonisent de manière stable l’intestin du ver. De plus, C. elegans est principalement hermaphrodite, produisant des populations de descendance génétiquement identique, ce qui réduit la variation génétique confondante. Couplé à la disponibilité de souches mutantes et transgéniques, la collaboration avec C. elegans offre aux chercheurs un modèle gnotobiotique et génétiquement traitable pour étudier les fondements moléculaires des interactions hôte-microbe 5,6,7,8.
Bien que les expériences avec des bactéries bien caractérisées puissent faciliter l’analyse des mécanismes moléculaires, l’identification et l’étude des bactéries avec lesquelles les vers interagissent dans la nature sont essentielles pour explorer la diversité de ces mécanismes, démêler le contexte naturel de leur fonction et comprendre les forces sélectives qui ont façonné leur évolution. À l’extérieur du laboratoire, C. elegans est présent à l’échelle mondiale dans les climats tempérés humides, où l’on pense que les populations subissent un cycle de vie « d’expansion et de récession », caractérisé par une croissance démographique rapide lorsque les ressources sont abondantes, suivie d’un changement de développement vers des dauers pionniers et tolérants au stress lorsque les ressources sont épuisées9. Bien qu’elles soient considérées comme un nématode du sol, les populations sauvages de C. elegans qui prolifèrent le plus souvent se nourrissent de matières organiques en décomposition telles que des fleurs ou des fruits en décomposition, où les populations bactériennes sont abondantes et diversifiées.
Des études sur le microbiome intestinal chez des nématodes isolés dans la nature ont identifié diverses communautés bactériennes, mais caractéristiques 10,11, dont la composition a été confirmée par des études menées avec des vers élevés dans des environnements microcosmiques naturels 12,13. Ensemble, ces études ont permis de délimiter un microbiome intestinal de ver central2. Alors que l’échantillonnage des populations de C. elegans dans la nature représente l’examen le plus direct des interactions naturelles ver-microbe, il n’est pas réalisable partout et à tout moment, car il est limité aux régions et aux saisons avec des précipitations abondantes10,11. Alternativement, au lieu d’isoler les vers de leur habitat naturel, des expériences utilisant des microcosmes amènent l’habitat naturel dans le laboratoire 6,8,12,13,14,15. Les environnements microcosmiques sont préparés à partir de sol composté avec divers fruits ou légumes, ce qui permet une plus grande diversification de la communauté du sol de départ. Ils offrent des méthodes expérimentales traitables qui combinent la diversité microbienne et l’environnement tridimensionnel du sol sauvage avec les avantages expérimentaux d’une installation de laboratoire contrôlée et de souches de vers génétiquement définies. Le protocole ci-dessous détaille les étapes impliquées dans le travail avec des microcosmes de compost, démontrant leur utilisation dans la compréhension de l’assemblage d’un microbiome intestinal caractéristique du ver dans divers environnements.
Le protocole présenté ici décrit une méthode pour étudier le microbiome intestinal des nématodes élevés dans des environnements naturels, offrant une approche alternative à l’isolement des vers de la nature ou à leur élevage sur des communautés synthétiques.
Les milliers d’espèces bactériennes potentielles capturées dans l’expérience représentative du microcosme reflètent la diversité microbienne avec laquelle les vers ont évolué et démontrent la capacité du pipeline de microcosmes à combiner les avantages de travailler avec un organisme hôte modèle et ceux de travailler avec des communautés microbiennes naturelles et diversifiées.
Les résultats représentatifs démontrent que l’enrichissement d’un sol commun avec différents types de produits module la diversité microbienne environnementale, mettant en évidence la gamme de diversité microbienne disponible pour l’exploration à l’aide de ce pipeline. Le choix des produits n’est pas particulièrement important. Des travaux antérieurs ont utilisé des bananes, des pommes, des oranges, des fraises, des feuilles de thé vert et des pommes de terre pour enrichir le sol, ce qui a entraîné une efficacité similaire pour élever les vers. Les produits mélangés ont également été utilisés efficacement. La caractéristique clé est que différents produits diversifieront un sol donné de différentes manières.
Malgré la grande variation de la diversité microbienne environnementale, les microbiomes intestinaux des vers varient considérablement moins, ce qui récapitule l’importance de la niche intestinale du ver et du filtrage de l’hôte pour l’assemblage d’un microbiome intestinal central distinct de celui de son environnement pédestre13. Ce modèle est mieux observé avec l’analyse pondérée UniFrac PCoA, démontrant que les différences entre les microbiomes environnementaux du sol et de l’intestin des vers proviennent principalement des différences dans l’abondance relative des taxons clés.
Bien que le protocole décrit ici se concentre sur la récolte de vers pour le séquençage 16S, les microcosmes peuvent être utilisés pour explorer d’autres questions d’intérêt. Par exemple, les vers récoltés dans des microcosmes peuvent ensuite être examinés pour déterminer l’effet d’un microbiome intestinal diversifié sur la résistance de l’hôte à diverses conditions défavorables, y compris des agents pathogènes ou des toxines. Alternativement, de nouvelles espèces et souches bactériennes peuvent être isolées et cultivées à partir de vers récoltés au sol, élargissant ainsi la diversité taxonomique et fonctionnelle des bactéries disponibles pour effectuer des expériences.
Alors que les méthodes de recherche en laboratoire recherchent la cohérence et la reproductibilité, le travail avec les microcosmes tire parti de la variation naturelle pour explorer les interactions hôte-microbe dans un contexte naturel. Néanmoins, cette variation pose également certains défis. Certains sols qui comprennent des niveaux élevés d’invertébrés endogènes peuvent nécessiter des étapes supplémentaires de centrifugation, de filtration et d’examen pour éliminer efficacement les organismes indésirables de la préparation du microcosme. De plus, une faible abondance microbienne dans le sol peut induire la formation indésirable de dauer dans les populations de vers, nécessitant une augmentation de l’extrait microbien ou enrichissant le sol avec une plus grande quantité de produits. Avec chaque expérience de microcosme réalisée, les chercheurs continuent d’explorer toute la diversité taxonomique et fonctionnelle fournie par la nature, permettant la découverte de nouveaux taxons microbiens et de capacités fonctionnelles allant de la résistance aux infections à la protection contre les xénobiotiques environnementaux.
The authors have nothing to disclose.
Le travail décrit dans ce manuscrit a été soutenu par les subventions NIH R01OD024780 et R01AG061302. K.T. a également été soutenu par une bourse de recherche d’été de premier cycle de l’Université de Californie à Berkeley, financée par la Rose Hills Foundation. Les dessins de bande dessinée de la figure 1 ont été obtenus à partir de BioRender.com.
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |