التقارب الخلوي للمستحلب المستقر للجسيمات لتعزيز استيعاب المستضد
Summary
لتصميم مواد مساعدة فعالة بشكل عقلاني ، قمنا بتطوير مستحلب بيكرينغ المستقر بالجسيمات النانوية (PNPE) من حمض اللاكتيك والجليكوليك. يمتلك PNPE نعومة فريدة وواجهة كارهة للماء للاتصال الخلوي القوي وقدم تحميلا عالي المحتوى للمستضد ، مما أدى إلى تحسين التقارب الخلوي لنظام التوصيل إلى الخلايا المقدمة للمستضد وإحداث استيعاب فعال للمستضدات.
Abstract
التقارب الخلوي للجسيمات الدقيقة / النانوية هو الشرط المسبق للتعرف الخلوي ، والامتصاص الخلوي ، والتنشيط ، والتي تعتبر ضرورية لتوصيل الدواء والاستجابة المناعية. نشأت الدراسة الحالية من ملاحظة أن تأثيرات شحنة وحجم وشكل الجسيمات الصلبة على تقارب الخلية عادة ما يتم أخذها في الاعتبار ، لكننا نادرا ما ندرك الدور الأساسي للنعومة وظاهرة إعادة الهيكلة الديناميكية وتفاعل الواجهة المعقدة في التقارب الخلوي. هنا ، قمنا بتطوير مستحلب بيكرينغ المستقر بالجسيمات النانوية (PNPE) الذي تغلب على أوجه القصور في الأشكال الصلبة ومحاكاة مرونة وسيولة مسببات الأمراض. تم إعداد طريقة لاختبار تقارب PNPE مع أسطح الخلايا وتوضيح الاستيعاب اللاحق للخلايا المناعية. تم تحديد تقارب PNPE مع الحويصلات خارج الخلية المحاكية الحيوية (bEVs) – بديل الخلايا المتغصنة لنخاع العظم (BMDCs) – باستخدام توازن دقيق من بلورات الكوارتز مع مراقبة التبديد (QCM-D) ، مما سمح بالمراقبة في الوقت الفعلي للالتصاق مستحلب الخلية. بعد ذلك ، تم استخدام PNPE لتوصيل المستضد (ovalbumin ، OVA) ولوحظ امتصاص المستضدات بواسطة BMDCs باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM). أظهرت النتائج التمثيلية أن PNPE انخفض على الفور التردد (ΔF) عندما واجه bEVs ، مما يشير إلى الالتصاق سريع وتقارب عال ل PNPE مع BMDCs. أظهر PNPE ارتباطا أقوى بكثير بغشاء الخلية من الجسيمات الدقيقة PLGA (PMPs) ومساعد AddaVax (يشار إليه باسم مستحلب النانو المستقر بالسطحي [SSE]). علاوة على ذلك ، نظرا للتقارب الخلوي المعزز للخلايا المناعية من خلال تغيرات الانحناء الديناميكي والانتشار الجانبي ، تم تعزيز امتصاص المستضد لاحقا مقارنة ب PMPs و SSE. يوفر هذا البروتوكول رؤى لتصميم تركيبات جديدة ذات تقارب خلوي عالي واستيعاب فعال للمستضد ، مما يوفر منصة لتطوير لقاحات فعالة.
Introduction
لمكافحة الأمراض الوبائية والمزمنة والمعدية ، من الضروري تطوير مواد مساعدة فعالة للتطعيمات الوقائية والعلاجية 1,2. من الناحية المثالية ، يجب أن تمتلك المواد المساعدة أمانا ممتازا وتنشيطا مناعيا3،4،5. يعتقد أن الامتصاص الفعال وعملية المستضدات بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) هي مرحلة أساسية في شلالات الإشارات النهائية وبدء الاستجابة المناعية6،7،8. ومن ثم ، فإن اكتساب فهم واضح لآلية تفاعل الخلايا المناعية مع المستضدات وتصميم المواد المساعدة لتعزيز الاستيعاب هي استراتيجيات فعالة لتعزيز كفاءة اللقاحات.
تم التحقيق سابقا في الجسيمات الدقيقة / النانوية ذات الخصائص الفريدة كأنظمة توصيل مستضد للتوسط في الامتصاص الخلوي للمستضدات والتفاعل الخلوي مع الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض 9,10. عند الاتصال بالخلايا ، تبدأ أنظمة التوصيل في التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية وغشاء الخلية ، مما أدى إلى الاستيعاب والاستجابات الخلوية اللاحقة11,12. كشفت الدراسات السابقة أن استيعاب الجسيمات يحدث من خلال التصاق جسيمات غشاء الخلية13 ، يليه تشوه مرن لغشاء الخلية وانتشار المستقبل إلى الغشاء السطحي14,15. في ظل هذه الظروف ، تعتمد خصائص نظام التسليم على التقارب مع ناقلات الجنود المدرعة ، مما يؤثر لاحقا على كمية الامتصاص16,17.
للحصول على نظرة ثاقبة حول تصميم نظام التوصيل لتحسين الاستجابة المناعية ، تم تركيز جهود مكثفة على التحقيق في العلاقة بين خصائص الجسيمات والامتصاص الخلوي. نشأت الدراسة الحالية من ملاحظة أن الجسيمات الدقيقة / النانوية الصلبة ذات الشحنات والأحجام والأشكال المختلفة غالبا ما تتم دراستها في ضوء ذلك ، في حين نادرا ما يتم التحقيق في دور السيولة في استيعاب المستضد18,19. في الواقع ، أثناء الالتصاق ، أظهرت الجسيمات اللينة تغيرات انحناء ديناميكية وانتشارا جانبيا لزيادة مساحة التلامس للتفاعلات متعددة التكافؤ ، والتي بالكاد يمكن تكرارها بواسطة الجسيمات الصلبة20,21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أغشية الخلايا عبارة عن طبقات ثنائية من الدهون الفوسفاتية (sphingolipids أو الكوليسترول) في موقع الامتصاص ، ويمكن للمواد الكارهة للماء أن تغير الإنتروبيا التوافقية للدهون ، مما يقلل من كمية الطاقة اللازمة لامتصاص الخلايا22,23. وبالتالي ، قد يكون تضخيم الحركة وتعزيز الكارهة للماء لنظام التوصيل استراتيجية فعالة لتعزيز استيعاب المستضد لتعزيز الاستجابة المناعية.
تم استخدام مستحلب Pickering ، الذي استقرت بواسطة جزيئات صلبة مجمعة عند الواجهة بين سائلين غير قابلين للامتزاج ، على نطاق واسع في المجال البيولوجي24,25. في الواقع ، تحدد الجسيمات المجمعة على السطح البيني للنفط / الماء صياغة هياكل متعددة المستويات ، والتي تعزز التفاعلات الخلوية لنظام التوصيل متعدد المستويات ، وتحفز بشكل أكبر الخصائص الفيزيائية الكيميائية متعددة الوظائف في توصيل الدواء. بسبب قابليتها للتشوه وحركتها الجانبية ، كان من المتوقع أن تدخل مستحلبات بيكرينغ في تفاعل خلوي متعدد التكافؤ مع الخلايا المناعية ويتم التعرف عليها بواسطة بروتينات الغشاء26. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن نوى المذيلة الزيتية في مستحلبات بيكرينغ غير مغطاة بالكامل بجزيئات صلبة ، فإن مستحلبات بيكرينغ لها فجوات بأحجام مختلفة بين الجسيمات الموجودة على واجهة الزيت / الماء ، مما يسبب مقاومة أعلى للماء. وبالتالي ، من الأهمية بمكان استكشاف تقارب مستحلبات بيكرينغ مع APCs وتوضيح الاستيعاب اللاحق لتطوير مواد مساعدة فعالة.
بناء على هذه الاعتبارات ، قمنا بتصميم مستحلب بيكرينغ المستقر للجسيمات النانوية PLGA (PNPE) كنظام توصيل لقاح سيولة ساعد أيضا في اكتساب رؤى قيمة في تقارب PNPE مع BMDCs والاستيعاب الخلوي. تمت مراقبة الالتصاق في الوقت الفعلي للحويصلات خارج الخلية المحاكية الحيوية (bEVs ؛ استبدال BMDCs) إلى PNPE عبر طريقة خالية من الملصقات باستخدام توازن دقيق من بلورات الكوارتز مع مراقبة التبديد (QCM-D). بعد توصيف تقارب PNPE إلى BMDCs ، تم استخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) لتحديد امتصاص المستضد. أشارت النتيجة إلى تقارب أعلى من PNPE إلى BMDCs ، والاستيعاب الفعال للمستضد. توقعنا أن يظهر PNPE تقاربا أعلى مع APCs ، مما قد يحفز بشكل أفضل استيعاب المستضدات لتعزيز الاستجابات المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطوير مستحلب الزيت / الماء المستقر بالجسيمات النانوية PLGA كنظام توصيل لتعزيز استيعاب المستضد. يمتلك PNPE المحضر سطحا معبأ بكثافة لدعم نقطة الهبوط ونعومة وسيولة فريدة من نوعها للاتصال الخلوي القوي بغشاء الخلية المناعية. علاوة على ذلك ، قدمت واجهة الزيت / الماء تحميلا عالي المحتوى للمست?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع مدعوم من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFE020527 ، 2021YFC2302605 ، 2021YFC2300142) ، من 0 إلى 1 مشروع الابتكار الأصلي لبرنامج البحث العلمي الحدودي الأساسي للأكاديمية الصينية للعلوم (ZDBS-LY-SLH040) ، مؤسسة مجموعات البحث المبتكرة التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21821005).
Materials
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l., et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D’Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
