تحديد النشاط المضاد للفطريات للببتيدات ضد المبيضات البيض
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على بيانات كمية عن النشاط المضاد للفطريات للببتيدات والمركبات الأخرى ، مثل العوامل المضادة للفطريات ذات الجزيئات الصغيرة ، ضد المبيضات البيض. إن استخدامه للكثافة الضوئية بدلا من حساب وحدات تشكيل المستعمرات لتحديد تثبيط النمو يوفر الوقت والموارد.
Abstract
الطرق التقليدية لإجراء اختبار الحساسية المضادة للفطريات للمبيضات البيض تستغرق وقتا طويلا وتفتقر إلى النتائج الكمية. على سبيل المثال ، يعتمد النهج الشائع على طلاء الخلايا المعالجة بتركيزات مختلفة من الجزيئات المضادة للفطريات على ألواح الآجار ثم عد المستعمرات لتحديد العلاقة بين تركيز الجزيء وتثبيط النمو. تتطلب هذه الطريقة العديد من اللوحات ووقتا طويلا لحساب المستعمرات. نهج شائع آخر يلغي لوحات وعد المستعمرات عن طريق الفحص البصري للثقافات المعالجة بالعوامل المضادة للفطريات لتحديد الحد الأدنى من التركيز المطلوب لمنع النمو ؛ ومع ذلك ، فإن الفحص البصري ينتج عنه نتائج نوعية فقط ، وتضيع المعلومات المتعلقة بالنمو عند تركيزات دون مثبطة. يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس حساسية C. albicans للببتيدات المضادة للفطريات. من خلال الاعتماد على قياسات الكثافة الضوئية للمزارع ، تقلل الطريقة من الوقت والمواد اللازمة للحصول على نتائج كمية حول نمو الثقافة بتركيزات مختلفة من الببتيد. يتم إجراء حضانة الفطريات بالببتيدات في صفيحة 96 بئرا باستخدام مخزن مؤقت مناسب ، مع ضوابط لا تمثل أي تثبيط للنمو وتثبيط نمو كامل. بعد الحضانة مع الببتيد ، يتم تخفيف معلقات الخلايا الناتجة لتقليل نشاط الببتيد ثم تنمو بين عشية وضحاها. بعد النمو بين عشية وضحاها ، يتم قياس الكثافة البصرية لكل بئر ومقارنتها بالضوابط الإيجابية والسلبية لحساب تثبيط النمو الناتج عند كل تركيز ببتيد. النتائج باستخدام هذا الفحص قابلة للمقارنة مع النتائج باستخدام الطريقة التقليدية لطلاء الثقافات على ألواح الآجار ، لكن هذا البروتوكول يقلل من النفايات البلاستيكية والوقت المستغرق في عد المستعمرات. على الرغم من أن تطبيقات هذا البروتوكول قد ركزت على الببتيدات المضادة للفطريات ، إلا أن الطريقة ستكون قابلة للتطبيق أيضا لاختبار جزيئات أخرى ذات نشاط مضاد للفطريات معروف أو مشتبه به.
Introduction
المبيضات البيض هي عضو في الجراثيم البشرية التي تستعمر العديد من المواقع ، بما في ذلك تجويف الفم والجلد والجهاز الهضمي والمهبل1. بالنسبة للمرضى الذين يعانون من نقص المناعة بسبب أمراض مثل فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) والعلاجات المثبطة للمناعة ، قد يؤدي استعمار C. albicans إلى داء المبيضات المحلي أو الجهازي 2,3. يمكن أن يكون استخدام العلاجات المضادة للفطريات ذات الجزيئات الصغيرة المتاحة حاليا ، مثل الأمفوتريسين B أو الأزول أو echinocandins ، معقدا بسبب مشاكل الذوبان والسمية ومقاومة العدوى للعلاجات 4,5. نظرا لقيود العوامل المضادة للفطريات الحالية ، يبحث الباحثون باستمرار عن جزيئات جديدة مضادة للفطريات لها نشاط ضد C. albicans.
الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) هي بديل محتمل للعوامل المضادة للفطريات ذات الجزيئات الصغيرةالحالية 6،7،8 ويقترح أن تكون أقل عرضة لتطور المقاومة مقارنة بالأدوية ذات الجزيئات الصغيرة9. AMPs هي مجموعة متنوعة من الببتيدات ، لكنها غالبا ما تكون كاتيونية ، مع مجموعة واسعة من النشاط10،11،12. تشمل AMPs ذات النشاط ضد C. albicans الببتيدات المعروفة من عائلات الهيستاتين والسيكروبين 13،14،15 ، جنبا إلى جنب مع الببتيدات الموصوفة مؤخرا مثل ToAP2 و NDBP-5.7 ومتغير الهيستاتين 5 K11R-K17R16,17. نظرا لقدرتها على علاج عدوى المبيضات ، فإن تحديد وتصميم AMPs الجديدة التي تستهدف C. albicans هو هدف مهم للعديد من المجموعات البحثية.
كجزء من عملية تطوير AMPs فعالة (وغيرها من العوامل المضادة للفطريات) التي تستهدف C. albicans ، يستخدم الاختبار في المختبر بشكل شائع لتحديد الببتيدات الواعدة. عادة ما تتضمن طرق اختبار النشاط المضاد للفطريات ضد C. albicans احتضان الخلايا ذات التخفيفات التسلسلية ل AMPs (في المخزن المؤقت أو المتوسط) في 96 لوحة بئر. تتوفر عدة طرق لتقييم النشاط المضاد للفطريات بعد الحضانة. تستخدم التقنية التي وصفها معهد معايير المختبرات السريرية تقييما بصريا بحتا لتعكر الآبار لتحديد الحد الأدنى للتركيز (MIC) للتثبيط الكامل للنمو (تثبيط 50٪ على الأقل لعوامل مضادة للفطريات مختارة ، مثل الأزول و echinocandins) ولا توفر أي تقدير كمي للنمو عند تركيزات فرعية من MIC18 . هناك نهج آخر شائع الاستخدام يتضمن تحديد الصلاحية بعد الحضانة باستخدام AMPs عن طريق طلاء محتويات الآبار على ألواح الآجار ، واحتضان الألواح ، ثم حساب عدد وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) على اللوحة. تم استخدام هذه الطريقة لتقييم عدد من الببتيدات ، بما في ذلك الببتيدات القائمة على الهيستاتين 5 ، LL-37 ، واللاكتوفيرين البشري19،20،21. تتطلب هذه التقنية حجما كبيرا نسبيا من الآجار وعددا كبيرا من الألواح وتتضمن العد الممل لوحدات CFU على اللوحات. للحصول على مزيد من البيانات الكمية مع توليد نفايات بلاستيكية أقل وتجنب عد وحدات CFU ، يمكن استخدام محتويات الآبار لتلقيح وسط جديد في لوحة أخرى من 96 بئرا. بعد احتضان الصفيحة الملقحة حديثا ، يمكن قياس النمو عن طريق قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) على قارئ لوحة الامتصاص. تم استخدام هذه الطريقة لتحديد النشاط المضاد للفطريات للهيستاتين 5 وشظايا تحلله والببتيدات المخترقة للخلايا17،22،23،24،25.
يصف هذا البروتوكول كيفية اختبار النشاط المضاد للفطريات للببتيدات ويستخدم طريقة OD600 لتحديد الانخفاض في صلاحية C. albicans بسبب الببتيدات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول نهجا فعالا للحصول على بيانات كمية عن النشاط المضاد للفطريات ل AMPs ضد الممرض الفطري C. albicans. أحد الأساليب البديلة الشائعة لاختبار الببتيدات والعوامل المضادة للفطريات الأخرى هو التخفيف الدقيق للمرق الموصوف في معيار M2718 التابع لمعهد معايير المختبرات السر?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R03DE029270 ، T32AI089621B) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (CBET 1511718) ، ووزارة التعليم (GAANN-P200A180093) ، ومنحة البذور عبر الحرم الجامعي بجامعة ميريلاند.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
References
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , (2021).
- de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
- Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
- Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
- Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
- Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
- Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature’s reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
- Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
- Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
- Mercer, D. K., O’Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
- Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
- Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
- Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
- Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
- do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
- Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard – Third edition. , (2008).
- Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
- Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
- den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
- Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
- Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
- Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
- Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, (2012).
- Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022)
- Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
- Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
- Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d’Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
- Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van’t Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
- Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
- Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
- Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
- Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
- Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).
