कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ पेप्टाइड्स की एंटिफंगल गतिविधि की मात्रा निर्धारित करना
Summary
यह प्रोटोकॉल कैंडिडा अल्बिकन्स के खिलाफ पेप्टाइड्स और अन्य यौगिकों, जैसे छोटे अणु एंटिफंगल एजेंटों की एंटिफंगल गतिविधि पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विकास अवरोध को मापने के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गणना के बजाय ऑप्टिकल घनत्व का इसका उपयोग समय और संसाधनों को बचाता है।
Abstract
कैंडिडा अल्बिकन्स के लिए एंटिफंगल संवेदनशीलता परीक्षण करने के पारंपरिक तरीके समय लेने वाले हैं और मात्रात्मक परिणामों की कमी है। उदाहरण के लिए, एक सामान्य दृष्टिकोण आगर प्लेटों पर एंटिफंगल अणुओं की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज की जाने वाली प्लेटिंग कोशिकाओं पर निर्भर करता है और फिर अणु एकाग्रता और विकास निषेध के बीच संबंध निर्धारित करने के लिए कॉलोनियों की गिनती करता है। इस विधि को कॉलोनियों की गिनती के लिए कई प्लेटों और पर्याप्त समय की आवश्यकता होती है। एक और सामान्य दृष्टिकोण विकास को रोकने के लिए आवश्यक न्यूनतम एकाग्रता की पहचान करने के लिए एंटिफंगल एजेंटों के साथ इलाज की गई संस्कृतियों का नेत्रहीन निरीक्षण करके प्लेटों और कॉलोनियों की गिनती को समाप्त करता है; हालांकि, दृश्य निरीक्षण केवल गुणात्मक परिणाम उत्पन्न करता है, और उप-निरोधात्मक सांद्रता में विकास पर जानकारी खो जाती है। यह प्रोटोकॉल एंटीफंगल पेप्टाइड्स के लिए सी अल्बिकन्स की संवेदनशीलता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व माप पर भरोसा करके, विधि विभिन्न पेप्टाइड सांद्रता पर संस्कृति विकास पर मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय और सामग्री को कम करती है। पेप्टाइड्स के साथ कवक का इनक्यूबेशन एक उपयुक्त बफर का उपयोग करके 96-वेल प्लेट में किया जाता है, जिसमें नियंत्रण कोई विकास निषेध और पूर्ण विकास निषेध का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। पेप्टाइड के साथ इनक्यूबेशन के बाद, परिणामस्वरूप सेल निलंबन पेप्टाइड गतिविधि को कम करने के लिए पतला हो जाता है और फिर रात भर उगाया जाता है। रात भर के विकास के बाद, प्रत्येक कुएं के ऑप्टिकल घनत्व को मापा जाता है और प्रत्येक पेप्टाइड एकाग्रता पर परिणामी विकास अवरोध की गणना करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना की जाती है। इस परख का उपयोग करने वाले परिणाम आगर प्लेटों पर संस्कृतियों को चढ़ाने की पारंपरिक विधि का उपयोग करने वाले परिणामों के बराबर हैं, लेकिन यह प्रोटोकॉल प्लास्टिक कचरे और कॉलोनियों की गिनती पर खर्च किए गए समय को कम करता है। यद्यपि इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोगों ने एंटिफंगल पेप्टाइड्स पर ध्यान केंद्रित किया है, विधि ज्ञात या संदिग्ध एंटिफंगल गतिविधि वाले अन्य अणुओं के परीक्षण पर भी लागू होगी।
Introduction
कैंडिडा अल्बिकन्स मानव माइक्रोबायोटा का एक सदस्य है जो मौखिक गुहा, त्वचा, जठरांत्र संबंधी मार्ग और योनि1 सहित कई स्थानों को उपनिवेशित करता है। उन रोगियों के लिए जो मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) और इम्यूनोसप्रेसिव उपचार जैसी बीमारियों के कारण इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड हैं, सी अल्बिकन्स के उपनिवेशीकरण से स्थानीय या प्रणालीगत कैंडिडिआसिस 2,3 हो सकता है। वर्तमान में उपलब्ध छोटे-अणु एंटिफंगल चिकित्सीय, जैसे एम्फोटेरिसिन बी, एज़ोल्स, या एचिनोकैंडिन का उपयोग, घुलनशीलता और विषाक्तता के मुद्दों और चिकित्सीय 4,5 के लिए संक्रमण के प्रतिरोध से जटिल हो सकता है। वर्तमान एंटिफंगल एजेंटों की सीमाओं के कारण, शोधकर्ता लगातार सी अल्बिकन्स के खिलाफ गतिविधि के साथ नए एंटिफंगल अणुओं की खोज कर रहे हैं।
रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (एएमपी) वर्तमान छोटे-अणु एंटिफंगलएजेंट6,7,8 के लिए एक संभावित विकल्प हैं और छोटे-अणु दवाओं की तुलना में प्रतिरोध के विकास के लिए कम संवेदनशील होने का प्रस्तावहै। एएमपी पेप्टाइड्स का एक विविध सेट है, लेकिन वे अक्सर धनिक होते हैं, जिसमें गतिविधि10,11,12 का व्यापक स्पेक्ट्रम होता है। अल्बिकन्स के खिलाफ गतिविधि वाले एएमपी में हिस्टोटिन और सेक्रोपिन परिवारों13,14,15 से प्रसिद्ध पेप्टाइड्स शामिल हैं, साथ ही हाल ही में वर्णित पेप्टाइड्स जैसे टीओएपी 2, एनडीबीपी -5.7, और हिस्टाटिन 5 संस्करण के 11 आर-के 17 आर 16,17। कैंडिडा संक्रमण के इलाज के लिए उनकी क्षमता के कारण, सी अल्बिकन्स को लक्षित करने वाले नए एएमपी की पहचान करना और डिजाइन करना कई शोध समूहों के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है।
प्रभावी एएमपी (और अन्य एंटिफंगल एजेंट) विकसित करने की प्रक्रिया के हिस्से के रूप में जो सी अल्बिकन्स को लक्षित करते हैं, इन विट्रो परीक्षण का उपयोग आमतौर पर आशाजनक पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए किया जाता है। अल्बिकन्स के खिलाफ एंटिफंगल गतिविधि का परीक्षण करने के तरीकों में आमतौर पर 96-वेल प्लेटों में एएमपी (बफर या मध्यम में) के सीरियल कमजोर पड़ने वाली कोशिकाओं को शामिल किया जाता है। इनक्यूबेशन के बाद एंटिफंगल गतिविधि का आकलन करने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। नैदानिक प्रयोगशाला मानक संस्थान द्वारा वर्णित एक तकनीक विकास के पूर्ण निषेध के लिए न्यूनतम एकाग्रता (एमआईसी) निर्धारित करने के लिए कुओं की टर्बिडिटी के विशुद्ध रूप से दृश्य मूल्यांकन का उपयोग करती है (चयनित एंटिफंगल एजेंटों के लिए कम से कम 50% अवरोध, जैसे एज़ोल्स और एचिनोकैंडिन) और उप-एमआईसी सांद्रता18 पर विकास का कोई परिमाणीकरण प्रदान नहीं करता है। . एक अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले दृष्टिकोण में एएमपी के साथ इनक्यूबेशन के बाद व्यवहार्यता को निर्धारित करना शामिल है, जिसमें आगर प्लेटों पर कुओं की सामग्री चढ़ाना, प्लेटों को इनक्यूबेट करना और फिर प्लेट पर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की संख्या की गणना करना शामिल है। इस विधि का उपयोग कई पेप्टाइड्स के मूल्यांकन के लिए किया गया है, जिसमें हिस्टैटिन 5-आधारित पेप्टाइड्स, एलएल -37 और मानव लैक्टोफेरिन 19,20,21 शामिल हैं। इस तकनीक के लिए अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में आगर और प्लेटों की एक उच्च संख्या की आवश्यकता होती है और इसमें प्लेटों पर सीएफयू की थकाऊ गिनती शामिल होती है। कम प्लास्टिक कचरे को उत्पन्न करते समय अधिक मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने और सीएफयू की गिनती से बचने के लिए, कुओं की सामग्री का उपयोग एक और 96-वेल प्लेट में ताजा माध्यम को टीका लगाने के लिए किया जा सकता है। नई टीका प्लेट को इनक्यूबेट करने के बाद, अवशोषण प्लेट रीडर पर 600 एनएम (ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापकर विकास की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस विधि का उपयोग हिस्टाटिन 5 की एंटिफंगल गतिविधि और इसके अवक्रमण टुकड़े और सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स 17,22,23,24,25 को निर्धारित करने के लिए किया गया है।
यह प्रोटोकॉल बताता है कि पेप्टाइड्स की एंटिफंगल गतिविधि का परीक्षण कैसे किया जाए और पेप्टाइड्स के कारण सी अल्बिकन्स की व्यवहार्यता में कमी को निर्धारित करने के लिए ओडी600 विधि का उपयोग किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल फंगल रोगज़नक़ सी अल्बिकन्स के खिलाफ एएमपी की एंटिफंगल गतिविधि पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण का वर्णन करता है। पेप्टाइड्स और अन्य एंटिफंगल एजेंटों के परीक?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (R03DE029270, T32AI089621B), नेशनल साइंस फाउंडेशन (CBET 1511718), शिक्षा विभाग (GAANN-P200A180093), और मैरीलैंड क्रॉस-कैंपस बीज अनुदान विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
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