כימות הפעילות האנטי פטרייתית של פפטידים נגד קנדידה אלביקנס
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ותרכובות אחרות, כגון חומרים אנטי-פטרייתיים בעלי מולקולות קטנות, כנגד קנדידה אלביקנס. השימוש בו בצפיפות אופטית במקום לספור יחידות יוצרות מושבה כדי לכמת עיכוב גדילה חוסך זמן ומשאבים.
Abstract
שיטות מסורתיות לביצוע בדיקות רגישות אנטי פטרייתיות לקנדידה אלביקנס גוזלות זמן רב וחסרות תוצאות כמותיות. לדוגמה, גישה נפוצה מסתמכת על ציפוי תאים המטופלים בריכוזים שונים של מולקולות אנטי פטרייתיות על לוחות אגר ולאחר מכן ספירת המושבות כדי לקבוע את הקשר בין ריכוז מולקולות ועיכוב גדילה. שיטה זו דורשת לוחות רבים וזמן ניכר לספירת המושבות. גישה נפוצה נוספת מבטלת את הצלחות ואת ספירת המושבות על ידי בדיקה חזותית של תרבויות שטופלו בחומרים אנטי פטרייתיים כדי לזהות את הריכוז המינימלי הדרוש לעיכוב הצמיחה; עם זאת, בדיקה חזותית מניבה תוצאות איכותיות בלבד, ומידע על גדילה בריכוזים תת-מעכבים הולך לאיבוד. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת הרגישות של C. albicans לפפטידים אנטי פטרייתיים. על ידי הסתמכות על מדידות צפיפות אופטיות של תרביות, השיטה מפחיתה את הזמן והחומרים הדרושים להשגת תוצאות כמותיות על גידול תרביות בריכוזי פפטידים שונים. הדגירה של הפטרייה עם פפטידים מתבצעת בצלחת של 96 בארות באמצעות חיץ מתאים, כאשר בקרות אינן מייצגות עיכוב גדילה ועיכוב גדילה מלא. לאחר הדגירה עם הפפטיד, מתלי התאים המתקבלים מדוללים כדי להפחית את פעילות הפפטיד ואז גדלים בן לילה. לאחר גדילה בין לילה, הצפיפות האופטית של כל באר נמדדת ומושווה לבקרות החיוביות והשליליות כדי לחשב את עיכוב הצמיחה המתקבל בכל ריכוז פפטידים. התוצאות באמצעות בדיקה זו דומות לתוצאות בשיטה המסורתית של ציפוי התרבויות על צלחות אגר, אך פרוטוקול זה מפחית את פסולת הפלסטיק ואת הזמן המושקע בספירת מושבות. למרות שהיישומים של פרוטוקול זה התמקדו בפפטידים אנטי פטרייתיים, השיטה תהיה ישימה גם לבדיקת מולקולות אחרות עם פעילות אנטי פטרייתית ידועה או חשודה.
Introduction
קנדידה אלביקנס היא חלק מהמיקרוביוטה האנושית שמאכלסת מקומות רבים, כולל חלל הפה, העור, מערכת העיכול והנרתיק1. עבור חולים מדוכאי חיסון עקב מחלות כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) וטיפולים מדכאי חיסון, הנשאות של C. albicans עלולה להוביל לקנדידה מקומית או מערכתית 2,3. השימוש בטיפולים אנטי-פטרייתיים במולקולות קטנות הזמינות כיום, כגון אמפוטריצין B, אזולים או אכינוקנדינים, יכול להיות מסובך על ידי בעיות מסיסות ורעילות ועל ידי עמידות של זיהומים לטיפולים 4,5. בשל המגבלות של חומרים אנטי פטרייתיים הנוכחיים, החוקרים מחפשים ללא הרף מולקולות אנטי פטרייתיות חדשות עם פעילות נגד C. albicans.
פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) הם חלופה פוטנציאלית לחומרים האנטי-פטרייתיים הנוכחיים של מולקולות קטנות 6,7,8 ומוצעים להיות פחות רגישים להתפתחות עמידות בהשוואה לתרופות בעלות מולקולות קטנות 9. AMPs הם קבוצה מגוונת של פפטידים, אבל הם לעתים קרובות קטיוניים, עם ספקטרום רחב של פעילות10,11,12. AMPs עם פעילות נגד C. albicans כוללים פפטידים ידועים ממשפחות היסטטין וצקרופין 13,14,15, יחד עם פפטידים שתוארו לאחרונה כמו ToAP2, NDBP-5.7, וגרסת היסטטין 5 K11R-K17R 16,17. בשל הפוטנציאל שלהם לטיפול בזיהומי קנדידה, זיהוי ועיצוב AMPs חדשים המכוונים ל– C. albicans הוא יעד חשוב עבור קבוצות מחקר רבות.
כחלק מהתהליך לפיתוח AMPs יעילים (וחומרים אנטי פטרייתיים אחרים) המכוונים ל– C. albicans, בדיקות חוץ גופיות משמשות בדרך כלל לזיהוי פפטידים מבטיחים. שיטות לבדיקת פעילות אנטי-פטרייתית נגד C. albicans כוללות בדרך כלל דגירה של תאים עם דילול סדרתי של AMPs (בחיץ או בתווך) בלוחות 96 בארות. קיימות מספר שיטות להערכת הפעילות האנטי פטרייתית לאחר הדגירה. טכניקה שתוארה על ידי מכון התקנים למעבדה קלינית משתמשת בהערכה חזותית טהורה של עכירות הבארות כדי לקבוע את הריכוז המינימלי (MIC) לעיכוב מוחלט של הצמיחה (עיכוב של לפחות 50% עבור חומרים אנטי פטרייתיים נבחרים, כמו azoles ו echinocandins) ואינה מספקת כימות של צמיחה בריכוזים sub-MIC18 . גישה נפוצה נוספת כוללת כימות הכדאיות לאחר הדגירה עם AMPs על ידי ציפוי תכולת הבארות על לוחות אגר, דגירה על הצלחות, ולאחר מכן ספירת מספר יחידות יוצרות מושבה (CFUs) על הצלחת. שיטה זו שימשה להערכת מספר פפטידים, כולל פפטידים מבוססי היסטטין 5, LL-37, ולקטופריןאנושי 19,20,21. טכניקה זו דורשת נפח גדול יחסית של אגר ומספר גבוה של צלחות וכרוכה בספירה מייגעת של CFUs על הצלחות. כדי לקבל נתונים כמותיים יותר תוך יצירת פחות פסולת פלסטיק והימנעות מספירת CFUs, ניתן להשתמש בתכולת הבארות כדי לחסן מדיום טרי בצלחת נוספת בת 96 בארות. לאחר הדגירה על הצלחת שזה עתה חוסנה, ניתן לכמת את הגידול על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD600) בקורא לוחות ספיגה. שיטה זו שימשה לקביעת הפעילות האנטי פטרייתית של היסטטין 5 ומקטעי הפירוק שלו ופפטידים חודרי תאים 17,22,23,24,25.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבדוק את הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ומשתמש בשיטת OD600 כדי לכמת את הפחתת הכדאיות של C. albicans עקב פפטידים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי פטרייתית של AMPs כנגד הפתוגן הפטרייתי C. albicans. גישה חלופית נפוצה אחת לבדיקת פפטידים וחומרים אנטי פטרייתיים אחרים היא מיקרודילול מרק המתואר בתקן M2718 של מכון התקנים למעבדות קליניות (CLSI), אך תקן זה מתמקד בהשגת תו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R03DE029270, T32AI089621B), הקרן הלאומית למדע (CBET 1511718), מחלקת החינוך (GAANN-P200A180093), ומענק זרעים חוצה קמפוסים של אוניברסיטת מרילנד.
Materials
| 96-well plates (round bottom) | VWR | 10062-902 | |
| Absorbance microplate reader | N/A | N/A | Any available microplate reader is sufficient |
| C. albicans strain SC5314 | ATCC | MYA-2876 | Other C. albicans may also be used |
| Hemocytometer | N/A | N/A | Can be used to make a standard curve relating cell number to OD600 |
| Microplate shaker | VWR | 2620-926 | |
| Peptide(s) | N/A | N/A | Peptides can be commercially synthesized by any reliable vendor; a purity of ≥95% and trifluoroacetic acid salt removal to hydrochloride salt are recommended |
| Reagent reservoirs for multichannel pipettors | VWR | 18900-320 | Simplifies pipetting into multiwell plates with multichannel pipettor |
| Sodium phosphate, dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | For making NaPB |
| Sodium phosphate, monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | For making NaPB |
| UV spectrophotometer | N/A | N/A | Any available UV spectrophotometer is sufficient |
| YPD medium powder | BD Life Sciences | 242820 | May also be made from yeast extract, peptone, and dextrose |
References
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Arya, N. R., Rafiq, N. B. Candidiasis. StatPearls. , (2021).
- de Oliveira Santos, G. C., et al. Candida infections and therapeutic strategies: Mechanisms of action for traditional and alternative agents. Frontiers in Microbiology. 9, 1351 (2018).
- Espinel-Ingroff, A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and filamentous fungi. Revista Iberoamericana de Micología. 25 (2), 101-106 (2008).
- Wang, X., et al. Delivery strategies of amphotericin B for invasive fungal infections. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (8), 2585-2604 (2021).
- Struyfs, C., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Membrane-interacting antifungal peptides. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 649875 (2021).
- Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: Classification, design, application and research progress in multiple fields. Frontiers in Microbiology. 11, 582779 (2020).
- Sarkar, T., Chetia, M., Chatterjee, S. Antimicrobial peptides and proteins: From nature’s reservoir to the laboratory and beyond. Frontiers in Chemistry. 9, 691532 (2021).
- Mahlapuu, M., Bjorn, C., Ekblom, J. Antimicrobial peptides as therapeutic agents: Opportunities and challenges. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (7), 978-992 (2020).
- Lei, J., et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. American Journal of Translational Research. 11 (7), 3919-3931 (2019).
- Mercer, D. K., O’Neil, D. A. Innate inspiration: Antifungal peptides and other immunotherapeutics from the host immune response. Frontiers in Immunology. 11, 2177 (2020).
- Bin Hafeez, A., Jiang, X., Bergen, P. J., Zhu, Y. Antimicrobial peptides: An update on classifications and databases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11691 (2021).
- Xu, T., Levitz, S. M., Diamond, R. D., Oppenheim, F. G. Anticandidal activity of major human salivary histatins. Infection and Immunity. 59 (8), 2549-2554 (1991).
- Helmerhorst, E. J., et al. Amphotericin B- and fluconazole-resistant Candida spp., Aspergillus fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (3), 702-704 (1999).
- Andra, J., Berninghausen, O., Leippe, M. Cecropins, antibacterial peptides from insects and mammals, are potently fungicidal against Candida albicans. Medical Microbiology and Immunology. 189, 169-173 (2001).
- do Nascimento Dias, J., et al. Mechanisms of action of antimicrobial peptides ToAP2 and NDBP-5.7 against Candida albicans planktonic and biofilm cells. Scientific Reports. 10, 10327 (2020).
- Ikonomova, S. P., et al. Effects of histatin 5 modifications on antifungal activity and kinetics of proteolysis. Protein Science. 29, 480-493 (2020).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . M27-A3. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved standard – Third edition. , (2008).
- Lupetti, A., et al. Candidacidal activities of human lactoferrin peptides derived from the N terminus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (12), 3257-3263 (2000).
- Han, J., Jyoti, M. A., Song, H. Y., Jang, W. S. Antifungal activity and action mechanism of histatin 5-halocidin hybrid peptides against Candida ssp. PLoS One. 11 (2), 0150196 (2016).
- den Hertog, A. L., et al. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane. Biochemical Journal. 388, 689-695 (2005).
- Ikonomova, S. P., Moghaddam-Taaheri, P., Jabra-Rizk, M. A., Wang, Y., Karlsson, A. J. Engineering improved variants of the antifungal peptide histatin 5 with reduced susceptibility to Candida albicans secreted aspartic proteases and enhanced antimicrobial potency. The FEBS Journal. 285 (1), 146-159 (2018).
- Moghaddam-Taaheri, P., Leissa, J. A., Eppler, H. B., Jewell, C. M., Karlsson, A. J. Histatin 5 variant reduces Candida albicans biofilm viability and inhibits biofilm formation. Fungal Genetics and Biology. 149, 103529 (2021).
- Gong, Z., Doolin, M. T., Adhikari, S., Stroka, K. M., Karlsson, A. J. Role of charge and hydrophobicity in translocation of cell-penetrating peptides into Candida albicans cells. AIChE Journal. 65 (12), 16768 (2019).
- Gong, Z., Karlsson, A. J. Translocation of cell-penetrating peptides into Candida fungal pathogens. Protein Science. 26 (9), 1714-1725 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth edition. 3, (2012).
- Consolidated Sterilizer Systems. Laboratory and Research Autoclaves Available from: https://consteril.com/wp-content/uploads/2020/12/CSS-Product-Brochure.pdf (2022)
- Rodriguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Diaz-Guerra, T. M., Mellado, E. Standardization of antifungal susceptibility variables for a semiautomated methodology. Journal of Clinical Microbiology. 39 (7), 2513-2517 (2001).
- Mbuayama, K. R., Taute, H., Strmstedt, A. A., Bester, M. J., Gaspar, A. R. M. Antifungal activity and mode of action of synthetic peptides derived from the tick OsDef2 defensin. Journal of Peptide Science. 28 (5), 3383 (2022).
- Rossignol, T., Kelly, B., Dobson, C., d’Enfert, C. Endocytosis-mediated vacuolar accumulation of the human ApoE apolipoprotein-derived ApoEdpL-W antimicrobial peptide contributes to its antifungal activity in Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (10), 4670-4681 (2011).
- Helmerhorst, E. J., Reijnders, I. M., van’t Hof, W., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V. A critical comparison of the hemolytic and fungicidal activities of cationic antimicrobial peptides. FEBS Letters. 449 (2-3), 105-110 (1999).
- Kerenga, B. K., et al. Salt-tolerant antifungal and antibacterial activities of the corn defensin ZmD32. Frontiers in Microbiology. 10, 795 (2019).
- Lee, I. H., Cho, Y., Lehrer, R. I. Effects of pH and salinity on the antimicrobial properties of clavanins. Infection and Immunity. 65 (7), 2898-2903 (1997).
- Li, X. S., Reddy, M. S., Baev, D., Edgerton, M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry. 278 (31), 28553-28561 (2003).
- Rothstein, D. M., et al. Anticandida activity is retained in P-113, a 12-amino-acid fragment of histatin 5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1367-1373 (2001).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Volume transfers with serological pipettes and micropipettors. Journal of Visualized Experiments. (63), e2754 (2012).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Report. 26, 100987 (2021).
- Goughenour, K. D., Balada-Llasat, J. M., Rappleye, C. A. Quantitative microplate-based growth assay for determination of antifungal susceptibility of Histoplasma capsulatum yeasts. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3286-3295 (2015).
