Hücre Dışı Trakea Greftleri için Düşük Doz Gama Radyasyonu Sterilizasyonu
Summary
Trakea doku nakli için sterilizasyonun sağlanması şarttır. Burada, organlar tarafından tamamen tolere edilen düşük doz gama ışınlaması kullanan bir sterilizasyon protokolü sunuyoruz.
Abstract
Bir naklin doğru şekilde gelişmesini sağlamanın ana kilit yönlerinden biri, ortamın sterilitesidir. Desellülarize trakea transplantasyonu, başlangıçta çevre ile temas halinde olan ve böylece başlangıçtan itibaren steril olmayan bir organın implante edilmesini içerir. Desellülarizasyon protokolü (deterjan sunumu [% 2 sodyum dodesil sülfat], sürekli karıştırma ve ozmotik şoklar yoluyla) aseptik önlemlere uygun olarak gerçekleştirilirken, sterilizasyon sağlamaz. Bu nedenle, ana zorluklardan biri, in vivo implantasyondan önce sterilitenin sağlanmasıdır. İnorganik malzemeler için belirlenmiş gama radyasyonu sterilizasyon protokolleri olmasına rağmen, organik malzemeler için böyle bir önlem yoktur. Ek olarak, inorganik malzemeler için yürürlükte olan protokoller organik malzemelere uygulanamaz, çünkü belirlenen radyasyon dozu (25 kGy) implantı tamamen tahrip eder. Bu makale, desellülarize bir tavşan trakeasında artmış bir radyasyon dozunun etkisini incelemektedir. Doz aralığını (kGy) koruduk ve sterilizasyonun sağlandığı minimum dozu bulana kadar yükseltilmiş dozları test ettik. Dozu belirledikten sonra, hem histolojik hem de biyomekanik olarak organ üzerindeki etkilerini inceledik. 0.5 kGy’nin kısırlığa ulaşmamasına rağmen, hem 1 kGy hem de 2 kGy’lik dozların, 1 kGy ile sterilizasyon elde etmek için gerekli minimum doz olduğunu belirledik. Mikroskobik çalışmalar, sterilize edilmemiş organlara kıyasla ilgili bir değişiklik göstermedi. Eksenel biyomekanik özellikler hiç değişmedi ve organın radyal olarak tolere edebileceği birim uzunluk başına kuvvette sadece hafif bir azalma gözlendi. Bu nedenle, 1 kGy’nin, hücre dışı hale getirilmiş tavşan trakeasının organ üzerinde minimum düzeyde bir etkiye sahip olarak tam sterilizasyonunu sağladığı sonucuna varabiliriz.
Introduction
Bir implantın sterilizasyonu, yaşayabilirliği için temel bir gerekliliktir; Aslında başarılı olduğu kanıtlanmış protezler steril bölgelere (kan damarları, kalp, kemik vb.) implante edilen protezlerdir. 1. Trakeanın iki yüzeyi vardır: dış ortamla temas halinde olan, bu nedenle steril olmayan bir yüzey ve steril olan mediastene doğru bir yüzey. Bu nedenle, trakea çıkarıldığı andan itibaren steril bir organ değildir. Daha sonraki hücre desellülarizasyon işleminin maksimum steril koşullarda gerçekleştirilmesine rağmen, sterilizasyon adımı2 değildir. Yabancı maddenin kendi içine implantasyonu, ürettiği probakteriyel mikro çevre nedeniyle enfeksiyon riski taşır3ve materyal sterilize edilmiş olsa bile, donörden alıcıya% 0.014’e kadar hastalık bulaşma riski taşır4. Trakeanın doğru vaskülarizasyonunu sağlamak için, hemen hemen tüm deneysel nakil protokollerinde, önce steril bir alana (kas, fasya, omentum, deri altı, vb.) heterotopik implant 5,6,7 uygulanır; Bunun nedeni, steril olmayan bir elementin bu ortama implante edilmesinin, 3. alanın enfeksiyonuna yol açmasıdır.
Steril bir implant elde etmek için bir dizi olası strateji vardır. Süperkritik CO2kullanımı, terminal sterilizasyonu 8,9’u sağlamıştır. Ultraviyole radyasyon veya perasetik asit, etanol, oksijen peroksit ve elektrolize su gibi maddelerle tedavi gibi diğer yöntemler, sterilizasyonda, neredeyse her zaman dozajlarına bağlı olarak farklı başarı oranları elde etmişlerdir, ancak implantların biyomekanik özelliklerini etkiledikleri gösterilmiştir. Gerçekten de, etilen oksit gibi bazı maddeler, implante edilen matrisin yapısını önemli ölçüde değiştirebilir ve hatta istenmeyen immünojenik etkilere neden olabilir. Bu nedenle, bu stratejilerin birçoğu biyolojik modellere uygulanamaz 2,10,11,12,13.
En çok çalışılan ve kabul gören sterilizasyon stratejisi, insanlara implante edilen tıbbi cihazların sterilizasyonu için ISO 11737-1: 2006 standardı tarafından 25 kGy’lik bir gama radyasyon dozu ile oluşturulan stratejidir. Bununla birlikte, bu düzenleme sadece inert, biyolojik olmayan elementlerin sterilizasyonuna odaklanmaktadır14,15. Ek olarak, karsinomun radikal tedavisinde radyoterapi dozları, tıbbi cihazları sterilize etmek için kullanılanlardan üç kat daha düşüktür1. Bunu akılda tutarak, söz konusu dozun sadece mikrobiyotayı öldürmekle kalmayıp aynı zamanda implantın biyolojik yapısını tahrip edeceği ve radikal bir şekilde değiştireceği sonucuna varabiliriz. Ayrıca, 1.9 kGy kadar düşük dozlar kullanıldığında ve17 alınan radyasyon dozuyla doğru orantılı hasar olsa bile, potansiyel olarak sitotoksik olabilen ve iskele 13,14,15,16,17’nin enzimatik bozunmasını hızlandırabilen bozunma üzerine artık lipitler üretme olasılığı da vardır.
Bu nedenle, bu makalenin amacı, ışınlamanın neden olduğu minimum zararlı etkiyle steril bir implantın elde edilmesini sağlayan radyasyon dozunu tanımlamaya çalışmaktır 2,18,19. İzlediğimiz strateji, negatif bir kültür elde edene kadar bir dizi kilogray (0.5, 1, 2, 3 kGy, vb.) içinde farklı dozlarda desellülarize edilmiş ve ışınlanmış trakeaların ışınlanmasını içeriyordu. Sterilizasyonu doğrulamak için negatif kültürlere ulaşan dozlar için ek testler yapılmıştır. Sterilizasyon elde etmek için minimum doz belirlendikten sonra, ışınlamanın trakea üzerindeki yapısal ve biyomekanik etkisi kontrol edildi. Tüm metrikler kontrol yerli tavşan trakeası ile karşılaştırıldı. Yapının sterilizasyonu daha sonra trakeaları Yeni Zelanda beyaz tavşanlarına implante ederek in vivo olarak test edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Var olan birkaç sterilizasyon stratejisi vardır. Süperkritik CO2, dokulara tamamen nüfuz eder, ortamı asitleştirir ve implantın basınçsızlaştırılması yoluyla basit eliminasyonla hücresel fosfolipid çift katmanını dekonstrüksiyona uğratır 8,14,25. Ultraviyole radyasyon da kullanılmıştır ve literatürde sadece birkaç rapor olmasına rağmen, kemirgen trakeasındaki etkinliği yayınlanmıştır…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makale, 2018 İspanyol Göğüs Cerrahisi Derneği Ulusal Çok Merkezli Çalışmaya Hibe [Sayı 180101 Néstor J.Martínez-Hernández’e verildi] ve PI16-01315 [Manuel Mata-Roig’e verildi] tarafından Instituto de Salud Carlos III tarafından desteklendi. CIBERER, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu’nun yardımıyla VI Ulusal Ar-Ge ve I Planı 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Programı, CIBER Eylemleri ve Instituto de Salud Carlos III tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch’ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories. Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
