Summary
Ottenere la sterilizzazione è essenziale per il trapianto di tessuto tracheale. Qui presentiamo un protocollo di sterilizzazione che utilizza l'irradiazione gamma a basso dosaggio che è completamente tollerato dagli organi.
Abstract
Uno dei principali aspetti chiave per garantire che un trapianto si evolva correttamente è la sterilità del terreno. Il trapianto tracheale decellularizzato comporta l'impianto di un organo che era originariamente a contatto con l'ambiente, quindi non essendo sterile fin dall'inizio. Mentre il protocollo di decellularizzazione (attraverso l'esposizione di detergenti [2% di sodio dodecilsolfato], agitazione continua e shock osmotici) è condotto in linea con misure asettiche, non prevede la sterilizzazione. Pertanto, una delle sfide principali è garantire la sterilità prima dell'impianto in vivo . Sebbene esistano protocolli di sterilizzazione con radiazioni gamma stabiliti per i materiali inorganici, non esistono tali misure per i materiali organici. Inoltre, i protocolli in vigore per i materiali inorganici non possono essere applicati ai materiali organici, poiché la dose di radiazioni stabilita (25 kGy) distruggerebbe completamente l'impianto. Questo articolo studia l'effetto di una dose di radiazioni aumentata in una trachea di coniglio decellularizzata. Abbiamo mantenuto l'intervallo di dosaggio (kGy) e testato dosi aumentate fino a trovare la dose minima alla quale si ottiene la sterilizzazione. Dopo aver determinato la dose, ne abbiamo studiato gli effetti sull'organo, sia istologicamente che biomeccanicamente. Abbiamo determinato che mentre 0,5 kGy non hanno raggiunto la sterilità, dosi di 1 kGy e 2 kGy lo hanno fatto, con 1 kGy, quindi, essendo la dose minima necessaria per ottenere la sterilizzazione. Gli studi microscopici non hanno mostrato cambiamenti rilevanti rispetto agli organi non sterilizzati. Le caratteristiche biomeccaniche assiali non sono state affatto alterate ed è stata osservata solo una leggera riduzione della forza per unità di lunghezza che l'organo può tollerare radialmente. Possiamo quindi concludere che 1 kGy raggiunge la completa sterilizzazione della trachea di coniglio decellularizzata con effetti minimi, se non nulli, sull'organo.
Introduction
La sterilizzazione di un impianto è un requisito fondamentale per la sua vitalità; Infatti, le protesi che si sono dimostrate efficaci sono quelle impiantate in zone sterili (vasi sanguigni, cuore, ossa, ecc.) 1. La trachea ha due superfici: una superficie a contatto con l'ambiente esterno, che quindi non è sterile, e una superficie verso il mediastino, che è sterile. Pertanto, dal momento in cui la trachea viene estratta, non è un organo sterile. Nonostante il successivo processo di decellularizzazione venga effettuato in condizioni di massima sterilità, non si tratta di una fase di sterilizzazione2. L'impianto di materiale estraneo comporta di per sé un rischio di infezione dovuto al microambiente probatterico che produce3e un rischio fino allo 0,014% di trasmissione della malattia dal donatore al ricevente, anche se il materiale è stato sterilizzato4. Per garantire una corretta vascolarizzazione della trachea, in quasi tutti i protocolli sperimentali di trapianto, viene prima sottoposto a impianto eterotopico 5,6,7 in una zona sterile (muscolo, fascia, omento, sottocutaneo, ecc.); Questo perché l'impianto di un elemento non sterile in questo mezzo porterebbe all'infezione dell'area3.
Ci sono una serie di possibili strategie per ottenere un impianto sterile. L'uso di CO2supercritico ha raggiunto la sterilizzazione terminale 8,9. Altri metodi, come la radiazione ultravioletta o il trattamento con sostanze come acido peracetico, etanolo, perossido di ossigeno e acqua elettrolizzata, hanno ottenuto percentuali di successo diverse nella sterilizzazione, quasi sempre a seconda dei loro dosaggi, ma hanno dimostrato di influenzare le caratteristiche biomeccaniche degli impianti. In effetti, alcune sostanze, come l'ossido di etilene, possono modificare sostanzialmente la struttura della matrice impiantata e possono persino causare effetti immunogenici indesiderati. Per questo motivo, molte di queste strategie non possono essere applicate ai modelli biologici 2,10,11,12,13.
La strategia di sterilizzazione più studiata e accettata è quella stabilita dalla norma ISO 11737-1:2006 per la sterilizzazione di dispositivi medici impiantati nell'uomo, con una dose di radiazioni gamma di 25 kGy. Tuttavia, questo regolamento si concentra solo sulla sterilizzazione di elementi inerti e non biologici14,15. Inoltre, le dosi di radioterapia nel trattamento radicale del carcinoma sono inferiori di tre ordini di grandezza rispetto a quelle utilizzate per sterilizzare i dispositivi medici1. Con questo in mente, possiamo concludere che tale dose non solo ucciderebbe il microbiota, ma distruggerebbe e altererebbe radicalmente la struttura biologica dell'impianto. C'è anche la possibilità che generi lipidi residui al momento della degradazione, che possono potenzialmente essere citotossici e accelerare la degradazione enzimatica dello scaffold 13,14,15,16,17, anche quando si utilizzano dosi basse come 1,9 kGy e con danni direttamente proporzionali alla dose di radiazioni ricevuta 17.
Pertanto, l'obiettivo di questo lavoro è cercare di identificare la dose di radiazioni che consente di ottenere un impianto sterile con effetti nocivi minimi causati dall'irradiazione 2,18,19. La strategia che abbiamo seguito prevedeva l'irradiazione di trachee decellularizzate e irradiate a diverse dosi aumentate all'interno di un intervallo di kilogray (0,5, 1, 2, 3 kGy, ecc.), fino a raggiungere una coltura negativa. Ulteriori test sono stati effettuati per quelle dosi che hanno raggiunto colture negative, al fine di confermare la sterilizzazione. Dopo aver determinato la dose minima per ottenere la sterilizzazione, è stato controllato l'impatto strutturale e biomeccanico dell'irradiazione sulla trachea. Tutte le metriche sono state confrontate con le trachee di coniglio native di controllo. La sterilizzazione del costrutto è stata poi testata in vivo impiantando le trachee nei conigli bianchi della Nuova Zelanda.
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Protocol
La direttiva europea 20170/63/UE per la cura e l'uso degli animali da laboratorio è stata rispettata e il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Valencia (Legge 86/609/CEE e 214/1997 e Codice 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 del Governo di Valencia, Spagna).
1. Decellularizzazione tracheale
NOTA: Il metodo di decellularizzazione è stato riportato altrove20.
- Eutanasia di conigli bianchi neozelandesi maschi adulti donatori (Oryctolagus cuniculus) del peso di 3,5-4,1 kg con 133 mg/kg di pentobarbital sodico, utilizzando un'iniezione di 200 mg/ml attraverso la vena marginale dell'orecchio.
- Garantendo condizioni asettiche, eseguire una cervicotomia longitudinale centrale, sezionare i muscoli cervicali e avvicinarsi alla trachea. Sezionare l'organo circonferenzialmente e longitudinalmente. Infine, transetto sotto il primo anello e appena sopra la carena.
- Con un bisturi, sezionare le trachee in pezzi di 2 cm. Con le forbici, rimuovere il tessuto connettivo circostante e lo strato di mucosa interna6.
- Immergere i campioni in 12 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente il 2% di sodio dodecilsolfato (SDS), il 5% di penicillina-streptomicina e il 5% di amfotericina B.
- Sottoporre le trachee ad agitazione costante con un agitatore magnetico a 400 giri / min per 5 settimane a temperatura ambiente. Sostituire settimanalmente la soluzione di decellularizzazione dopo uno shock osmotico di 2 ore, mediante immersione della trachea in acqua distillata.
- Criogenetizzare i campioni utilizzando una miscela da 12 ml di siero bovino fetale (FBS) all'80% e dimetilsolfossido (DMSO) al 20% in un contenitore di congelamento a -80 °C.
- Quando le trachee verranno utilizzate (dopo 13-15 giorni), scongelarle a bagnomaria a 37 °C e lavarle immergendole in PBS al termine dello scongelamento.
2. Sterilizzazione
- Irradiamento
- Introdurre i lotti di quattro pezzi tracheali di 2 cm ciascuno in un matraccio da 20 mL di metacrilato in un matraccio di coltura T25 riempito con PBS fino a raggiungere un volume totale di 30 ml. Fare attenzione a prevenire la formazione di bolle, che potrebbero causare la diffusione di energia nell'interfaccia aria-liquido.
- Condurre l'irradiazione utilizzando un acceleratore lineare, con fotoni di un'energia nominale di 10 MV che appiattiscono fasci liberi di filtri. Applicare un'intensità di dose di 2.400 unità di monitoraggio al minuto all'isocentro, ponendo le trachee ad una distanza sorgente-superficie di 100 cm da irradiare, con una profondità di campo di 2,5 cm per un campo di radiazione di 10 cm x 10 cm - in modo da coprire l'intero contenitore - corrispondente ad una dose di 24 Gy/min.
- Aumentare le dosi con ogni lotto di quattro pezzi; quattro pezzi saranno sottoposti a 0,5 kGy, da quattro a 1 kGy, da quattro a 2 kG, ecc., Fino al raggiungimento della sterilizzazione.
- Cultura
- Introdurre i pezzi in 30 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con FBS inattivato al 10% senza antibiotici o antimicotici.
- Coltivarli in un incubatore tissutale standard a 37 °C e 5% di CO 2 per2 settimane e ispezionarli ogni 24 ore.
NOTA: I parametri di contaminazione sono cambiamenti nel pH del terreno di coltura e, di conseguenza, cambiamenti nel colore e nella torbidità del terreno. Le trachee sono state raccolte da lagomorfi privi di germi, che non erano malati e, quindi, ci si aspettava che fossero privi di batteri anaerobici nelle loro trachee.
3. Analisi istologica
NOTA: Macchiare i pezzi usando ematossilina ed eosina21, tricroma di Masson e orceina22.
- Colorazione DAPI
- Determinare la vitalità tissutale utilizzando DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo). Questa colorazione blu-fluorescente si lega fortemente alle regioni ricche di adenina e timina nelle sequenze di DNA e quindi consente di visualizzare il DNA tramite microscopia a fluorescenza.
- Incorporare i campioni di tessuto nel composto a temperatura di taglio ottimale (OCT).
- Tagliare i campioni usando un criostato.
- Lavare il campione da tingere tre volte in acqua distillata per rimuovere l'OCT. Posizionare in un mezzo di montaggio che includa una soluzione 30 nM di DAPI.
- Visualizza la fluorescenza utilizzando la microscopia a fluorescenza.
- Analisi del contenuto di DNA
- Tagliare segmenti di trachea lunghi circa 3 mm usando un bisturi.
- Incubare per 2 ore in proteinasi K (Tabella dei materiali).
- Estrarre il DNA con un kit di estrazione del DNA, seguendo le istruzioni del produttore.
- Per mezzo della spettrofotometria, determinare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza a 260/280 utilizzando uno spettrofotometro.
- Misurare la dimensione dei campioni di DNA estratti utilizzando la cromatografia capillare con un bioanalizzatore.
4. Studio biomeccanico
NOTA: La resistenza tracheale alle forze longitudinali e trasversali viene misurata mediante prove di trazione assiale e di compressione radiale23.
- Misurazione tracheale
- Misurare la lunghezza tracheale, lo spessore della parete e il diametro esterno utilizzando una pinza Vernier.
- Calcola i valori medi di tre misurazioni casuali di ciascuna delle variabili.
- Nei test di compressione radiale, calcolare il diametro anteroposteriore rilevando il punto in cui la piastra entra in contatto con il campione.
- Eseguire tutti i test a temperatura ambiente.
- Prove di trazione
- Eseguire prove di trazione su una macchina di prova universale (UTM) per la trazione con controllo dello spostamento della macchina di prova universale (UTM), dotata di un carico di 100 N (risoluzione della forza 0,1 N, 0,001 mm di posizione e 0,1 s). La macchina di prova è dotata di sensori di forza e posizione, ed è collegata ad un computer con software appositamente progettato dal produttore23.
- Registra i dati ogni 0,4 s ed esporta in un foglio di calcolo.
- Costruire ganasce di trazione adattate al calibro medio delle trachee di coniglio da tubi cavi in polivinilcloruro (PVC) cristallino monostrato puro e atossico con un diametro esterno di 1 cm e uno spessore della parete di 1,5 mm.
- Sezione le condotte in segmenti lunghi 3 cm.
- Praticare 12 fori preformati per la sutura termino-terminale, a 2 mm dal bordo delle ganasce e separati da una distanza di 2,5 mm, per evitare distorsioni dovute alle suture.
- Attaccare i tubi di vetro in PVC alla trachea del coniglio mediante anastomosi termino-terminale con una sutura continua attraverso fori preformati alternati (ogni 5 mm), a 2 mm di distanza dal bordo della trachea e con una sutura monofilamento di nylon 6-0.
- Allungare tutti i pezzi con una velocità di spostamento di 5,0 mm/min.
- Registrare le variabili massima sollecitazione (σ max, in N/mm2) e deformazione (εmax, senza unità), insieme all'energia immagazzinata per unità di volume tracheale (W/Vol, in mJ/mm) e al modulo di Young (E, in MPa).
- Test di compressione radiale
- Eseguire test di compressione radiale su un UTM desktop di compressione, dotato di una cella di carico da 15 N (risoluzione forza 0,001 N, posizione 0,001 mm e tempo 0,1 s) per ottenere dati di forza (N), posizione (mm) e tempo (s). Registra i dati ed esporta su foglio di calcolo a intervalli di 0,5 s.
- Posizionare le trachee con la zona membranosa appoggiata sulla piastra inferiore. La piastra sale gradualmente verso la piastra superiore ad una velocità costante di 5 mm/min.
- Calcolare ogni unità per unità di lunghezza del campione (f in N/mm), rigidità (R in Mpa·mm) e l'energia per unità di superficie (W / S in mJ / mm2) necessaria per occludere completamente la trachea.
5. Tecnica chirurgica
NOTA: La tecnica chirurgica è stata ampiamente riportata altrove20.
- Posizionare uno stent sterile in PVC intraluminale, di dimensioni 14 Fr (che gli consenta di scivolare liberamente senza comprimere le pareti), con un margine di 3-4 mm a ciascuna estremità.
- Fissare lo stent con un singolo punto monofilamento di nylon 6-0 attraverso lo spazio intercartilagineo della prima cartilagine.
- Procedere ad anestetizzare i conigli.
- Pre-medicare i soggetti (conigli bianchi neozelandesi maschi di 3,65-4,05 kg) con analgesici intramuscolari (35 mg/kg di ketamina) con un sedativo, miorilassante e analgesico (2,5 mg/kg xilazina).
- Rasare la zona di incisione fuori dalla zona operatoria e pulire l'area chirurgica per rimuovere i capelli.
- Somministrare analgesici più profilassi antibiotica: 0,05 mg/kg di buprenorfina intramuscolare e 10 mg/kg di enrofloxacina.
- Metti un catetere venoso nella vena dell'orecchio marginale di ciascun coniglio.
- Indurre l'anestesia con un bolo endovenoso di 10 mg/kg di propofol.
- Monitorare i segni vitali dell'animale utilizzando un elettrocardiogramma a tre derivazioni, pulsossimetria e misurazione della pressione non invasiva. Ogni 30 minuti, applicare siero fisiologico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Verificare il piano anestetico utilizzando il metodo del pizzicamento della punta.
- Mantenere l'anestesia con isoflurano inalato all'1,5%-2% della concentrazione alveolare minima senza perdere la ventilazione spontanea e fornire supporto termico al coniglio con una piastra riscaldante.
- Disinfettare la zona di incisione più volte con un movimento circolare con uno scrub a base di iodio. In condizioni asettiche in ogni momento e con materiale sterile, praticare un'incisione toracica centrale longitudinale di 3 cm e raccogliere lembi peduncolari bilaterali composti da fascia pettorale e una componente muscolare.
- Avvolgere le trachee con il lembo in quattro conigli, uno su ciascun emitorace (quindi, un totale di otto trachee).
- Quando l'intervento è completato, invertire l'anestesia interrompendo la somministrazione di isoflurano.
- Periodo post-chirurgico
- Tenere gli animali in sala operatoria fino a quando non si sono completamente ripresi dall'anestesia. Quando si sono completamente ripresi, riportateli nel loro ambiente con altri conigli.
- Trattare i conigli con antibiotici (0,5 ml/kg di enrofloxacina al 2,5%) e analgesici (5 mg/ml di meloxicam; 0,05 ml/kg di metacam) ogni 24 ore per 5 giorni.
- Lasciare gli impianti in situ per il tempo desiderato.
- Prima dell'eutanasia, premedicare i conigli con analgesici intramuscolari (35 mg/kg di ketamina) e un sedativo, miorilassante e analgesico (2,5 mg/kg di xilazina). Quindi eutanasia i conigli con 133 mg / kg di pentobarbital sodico usando un'iniezione di 200 mg / ml attraverso la vena dell'orecchio marginale e raccogliere le trachee.
- Eseguire test biomeccanici e istologici sulle trachee.
6. Analisi statistica
- Regolare tutti i modelli con il metodo bayesiano sul software R, versione 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
- Analizzare le variabili di studio, ad eccezione di f e R, utilizzando più modelli di regressione lineare.
- Per le variabili f e R , applicare modelli di regressione lineare mista. In questi modelli, oltre alle variabili di interesse legate al trattamento e alla condizione di ogni trachea, introdurre la percentuale di occlusione come effetto monotono e un termine indipendente per trachea come fattore casuale.
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Representative Results
Decellularizzazione
La colorazione DAPI mostra l'assenza di DNA e nessun valore di DNA superiore a 50 ng è stato rilevato in nessuna delle trachee mediante elettroforesi, con tutti i frammenti più piccoli di 200 bp20.
Coltura microbica
Due degli otto pezzi sottoposti a 0,5 kGy hanno mostrato un cambiamento di colore in meno di 1 settimana. Nessuno dei pezzi irradiati a 1 kGy e 2 kGy ha mostrato alcun cambiamento di colore (Figura 1).
Analisi istologica
Non sono state rilevate modifiche al modello di distribuzione del collagene o delle fibre elastiche in nessuno dei campioni analizzati (Figura 2).
Determinazione della dose di radiazioni
Dati i risultati sopra descritti, che hanno dimostrato che l'irradiazione a 0,5 kGy non garantiva la sterilizzazione del campione, mentre dosi di 1 kGy e 2 kGy sì, abbiamo stabilito la dose minima possibile di irradiazione per ottenere la sterilizzazione del tessuto come 1 kGy. Pertanto, abbiamo testato l'impatto biomeccanico di questa dose sulle trachee 2,17,23.
Studio biomeccanico
Prove di trazione assiale
I dati ottenuti nella prova di trazione sulle trachee irradiate sono riportati nel prospetto 1. La figura 3 mostra le corrispondenti curve sforzo-deformazione e i punti di rottura.
Pertanto, sottoporre i pezzi tracheali all'irradiazione gamma a fini di sterilizzazione, nonostante l'aumento leggermente dei valori rilevati, non causa effetti significativi sulle caratteristiche biomeccaniche assiali degli organi. Quindi, sia il σmax che la trachea può tollerare (0,05 MPa; CI [-0,046, 0,144] MPa), nonché εmax (0,096 CI [-0,096, 0,281]), (0,022 MPa; CI [-0.23, 0.274] MPa), e W / Vol (da 0.044 mJ / mm3; CI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), sono leggermente aumentati in questo campione, ma non sono in ogni caso applicabili alla stima della popolazione.
Test di compressione radiale
Le prove di compressione eseguite sia sulle trachee native (controlli) che sulle trachee decellularizzate, crioconservate e irradiate sono mostrate nella Tabella 2. I grafici corrispondenti possono essere visti nella Figura 4.
L'irradiazione gamma provoca solo una diminuzione minima ma significativa delle caratteristiche biomeccaniche radiali nella forza variabile per unità di lunghezza, che varia di -0,017 N/mm; CI [-0,042, -0,004] N/mm, mentre le variazioni minime rilevate in W/Vol (0,044 mJ/mm3; CI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), R (-0,018 MPa · mm; CI [-0,145, 0,083] MPa · mm) e W/S (-0,081 mJ/mm2; CI [-0,95, 0,74] mJ/mm2), non sono in alcun caso applicabili alla stima della popolazione (Figura 5).
Impianto
Esame macroscopico
Nessuno degli animali ha mostrato sintomi infiammatori o infettivi durante il periodo postoperatorio; La loro dieta è stata ripristinata come previsto e antibiotici e analgesici sono stati sospesi il quinto giorno. Dopo l'eutanasia, l'integrazione della trachea e del lembo è stata osservata macroscopicamente, senza segni visibili di infiammazione.
Esame istologico
L'esame istologico ha mostrato che il lembo forma tessuto connettivo altamente organizzato - strettamente legato agli anelli tracheali, mostrando continuità tra loro e il tessuto - nella forma del pericondrio della trachea nativa. La cartilagine era intatta e non mostrava segni di necrosi. Inoltre, è stata osservata la presenza di macrofagi e alcune cellule giganti isolate che formano fogli. Oltre alla scarsa presenza di eosinofili, è stata osservata la solita lievita cellularità infiammatoria acuta postchirurgica (Figura 6). Neovascolarizzazione incipiente è stata osservata anche intorno alla trachea.
Valutazione biomeccanica
Dopo essere stato impiantato nel lagomorfo, le caratteristiche della trachea sono rimaste invariate, ad eccezione della forza per unità di lunghezza, che ha recuperato le caratteristiche della trachea nativa solo 2 settimane dopo il trapianto (0,006 N/mm, CI [-0,026, 0,04] N/mm) (Figura 7).
Figura 1: Trachee irradiate in DMEM senza antibiotici o antimicotici. Il colore dei due esemplari a sinistra (0,5 kGy) è cambiato, indicando un cambiamento nel pH, ed è un segno indiretto di crescita batterica. C'è anche una maggiore torbidità nel primo esemplare a sinistra. I due esemplari a destra (1 kGy) non mostrano alcun cambiamento di colore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Trachee decellularizzate e irradiate a diverse dosi. Ad ogni fila corrisponde una colorazione diversa e ad ogni colonna un diverso dosaggio di sterilizzazione. 1) Ematossilina-eosina. Vista panoramica della cartilagine, della mucosa, della sottomucosa e della sierosa. 2) Macchia tricromea di Masson. Sottomucosa tracheale. 3) Ematossilina-eosina. Vista dettagliata della cartilagine tracheale. A) Trachee non irradiate (controllo). B) Trachee irradiate a 0,5 kGy. C) Trachee irradiate a 1 kGy. D) Trachee irradiate a 2 kGy. Si osserva l'assenza di cambiamenti istologici oggettivi rispetto alla dose di radiazioni. Abbreviazione: N = trachea nativa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Curve sforzo-deformazione per trachee decellularizzate e irradiate. Il punto di rottura è segnato in arancione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Curve per percentuale di occlusione corrispondente alle prove di trazione nelle trachee decellularizzate e irradiate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Risposta biomeccanica all'irradiazione. (A) Grafico degli effetti marginali sulla forza variabile per unità di lunghezza, secondo la percentuale di occlusione dell'interazione di irradiazione. (B) Grafico degli effetti marginali sulla forza variabile per unità di lunghezza, secondo la percentuale di occlusione dell'interazione di irradiazione. (C) Grafico di dipendenza parziale del modello di energia immagazzinata per unità di area per la variabile di irradiazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Vista della trachea impiantata a 2 settimane . (A) Colorazione tricromica di Masson. Si osserva tessuto connettivo neoformato della superficie esterna tracheale organizzata in strati concentrici di fibre e cellule. (B) Ematossilina-eosina. Vista panoramica della cartilagine perfettamente conservata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Grafico degli effetti marginali dell'interazione tra forza per unità di lunghezza e percentuale di occlusione e trachee di controllo (native) rispetto agli impianti di trachea a 2 settimane. Clicca qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Prospetto 1: Prove di trazione su trachee irradiate. I controlli sono trachee di coniglio native. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Prove di compressione su trachee decellularizzate irradiate. I controlli sono trachee di coniglio native. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Esistono diverse strategie di sterilizzazione. La CO2supercritica penetra completamente nei tessuti, acidificando il mezzo e decostruendo il doppio strato fosfolipidico cellulare con semplice eliminazione mediante depressurizzazione dell'impianto 8,14,25. È stata utilizzata anche la radiazione ultravioletta ed è stata pubblicata la sua efficacia nella trachea dei roditori, sebbene ci siano solo pochi rapporti in letteratura10. Altri metodi utilizzati includono l'applicazione di sostanze come acido peracetico, etanolo, perossido di ossigeno o acqua elettrolizzata, che hanno dato risultati irregolari e hanno dimostrato di influenzare notevolmente il tessuto11,12. In contrasto con le strategie di cui sopra, l'irradiazione gamma non solo ha dimostrato di essere completamente efficace in termini di sterilizzazione, ma è stata anche studiata in modo approfondito e abbondante, sia per quanto riguarda la sua dose che gli effetti sterilizzanti. Infatti, è stato studiato così tanto che esiste uno standard ISO per l'uso delle radiazioni gamma nella sterilizzazione, in cui la dose per la sterilizzazione del materiale inerte da impiantare nell'uomo è stabilita a 25 kGy13,14,15.
D'altra parte, oltre al materiale sterilizzante, è stato anche dimostrato che l'irradiazione causa effetti collaterali come limitazione della tecnica. Questi includono la distruzione e l'alterazione delle matrici denaturando le molecole proteiche, incluso il collagene, e generando molecole residue, che possono persino diventare tossiche. Questo degrado della struttura degli organi influisce di conseguenza sia sulle sue caratteristiche biologiche che biomeccaniche, con gli effetti deleteri dell'irradiazione direttamente proporzionali alla sua dose e osservati a dosi relativamente basse 13,14,15,16,17. In questo caso, l'obiettivo era quindi duplice: da un lato, ottenere un costrutto sterile al fine di garantire un impianto vitale, e dall'altro preservare le caratteristiche biologiche e biomeccaniche della matrice, poiché l'impianto sarebbe stato inutile se entrambi non fossero stati mantenuti26. Pertanto, la sfida consisteva nel selezionare una strategia che consentisse un equilibrio tra sterilizzazione di successo e conservazione della struttura dei tessuti.
Qui, 1 kGy è stata stabilita come dose minima per la sterilizzazione. L'esame istologico ha dimostrato che questa dose di irradiazione non ha alcun impatto sul tessuto. Inoltre, la caratterizzazione biomeccanica delle trachee irradiate ha determinato che l'uso dell'irradiazione non fa assolutamente alcuna differenza per i parametri di trazione. C'è stata una leggera ma statisticamente significativa diminuzione della forza per unità di lunghezza che la trachea è stata in grado di tollerare nei test di compressione radiale, tuttavia ciò non influisce sulle sue altre caratteristiche radiali.
Mentre ci sono alcuni articoli che discutono l'impossibilità di sterilizzazione e la destrutturazione causata da dosi a partire da 1,5 kGy 19, la stragrande maggioranza è in linea con i dati presentati 2,18,19. In questo modo, gli autori osservano che la sterilizzazione dell'osso a dosi di 10, 15, 20 e 25 kGy raggiunge la completa sterilizzazione, sebbene in cambio di una riduzione della capacità di incubazione cellulare e di un aumento dei prodotti di degradazione del collagene a dosi superiori a 15 kGy18. Una dose di 1,5 kGy non ha ottenuto la sterilizzazione nelle valvole cardiache decellularizzate, ma ha causato danni alle qualità meccaniche dei campioni sia in vivo che in vitro; nel frattempo, una dose di 3 kGy ha raggiunto la sterilizzazione, ma ha causato destrutturazione e fibrosi19. Per quanto riguarda la trachea, Johnson et al. hanno confrontato gli effetti della sterilizzazione alla dose ISO di 25 kGy con una dose di 5 kGy. Entrambe le dosi hanno ottenuto la sterilizzazione terminale, con la dose di 5 kGy che altera leggermente la struttura del campione e la dose di 25 kGy che destruttura completamente la trachea2.
Inoltre, l'efficacia della sterilizzazione è confermata grazie all'assenza di eventi infettivi per quanto riguarda l'impianto dopo 2 settimane, con la sterilizzazione pienamente tollerata dagli organi. Inoltre, la struttura è stata completamente conservata, senza necrosi o denaturazione dell'organo. Inoltre, come ulteriore risultato, è stato osservato che la minore alterazione delle caratteristiche biomeccaniche - alla forza che la trachea è in grado di tollerare per unità di lunghezza - è tornata ai valori di una trachea nativa solo 2 settimane dopo l'impianto; Pertanto, questo effetto può essere ignorato per quanto riguarda la gestione finale del costrutto.
Pertanto, questo documento presenta la possibilità di ottenere organi completamente sterili a dosi molto inferiori rispetto alla dose raccomandata di 25 kGy; la proposta risolve i problemi della sterilizzazione delle trachee di coniglio neozelandesi con una dose di 1 kGy. Questa dose assicura che le caratteristiche istologiche, ultrastrutturali e biomeccaniche di questi organi siano mantenute e mostra una perfetta tolleranza all'impianto. Una limitazione dello studio è che è condotto solo su trachee di coniglio sterilizzate, che generalmente richiedono un dosaggio inferiore a causa delle dimensioni più piccole; tuttavia, si può concludere che le cifre eccessivamente elevate stabilite nello standard ISO per gli impianti inerti non sono necessarie per la sterilizzazione delle trachee decellularizzate, essendo quindi un enorme risultato a causa del danno notevolmente ridotto al tessuto. Inoltre, in studi futuri, a seconda dell'animale, e quindi delle dimensioni della sua trachea, queste dosi possono essere aggiustate a dosi molto più basse che sono di conseguenza più rispettose della struttura e della funzione dell'organo.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo documento è stato supportato dalla Sovvenzione 2018 della Società Spagnola di Chirurgia Toracica allo Studio Nazionale Multicentrico [Numero 180101 assegnato a Néstor J.Martínez-Hernández] e PI16-01315 [assegnato a Manuel Mata-Roig] dall'Instituto de Salud Carlos III. CIBERER è finanziato dal VI Piano Nazionale R&S&I 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions e dall'Instituto de Salud Carlos III, con l'assistenza del Fondo Europeo di Sviluppo Regionale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
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