نبلغ عن غرفة بيئية مرنة على قمة المسرح لتصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية باستخدام مجهر تشتت رامان المحفز المستقيم مع اكتشاف الإشارات المرسلة. تم تصوير قطرات الدهون في خلايا SKOV3 المعالجة بحمض الأوليك لمدة تصل إلى 24 ساعة مع فاصل زمني مدته 3 دقائق.
الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) هو تقنية تصوير كيميائي خالية من الملصقات. تم عرض تصوير الخلايا الحية باستخدام SRS للعديد من التطبيقات البيولوجية والطبية الحيوية. ومع ذلك ، لم يتم اعتماد تصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية على نطاق واسع. غالبا ما يستخدم الفحص المجهري SRS هدف الغمر في الماء بفتحة عددية عالية (NA) ومكثف غمر زيت NA عالي لتحقيق تصوير عالي الدقة. في هذه الحالة ، تكون الفجوة بين الهدف والمكثف بضعة ملليمترات فقط. لذلك ، لا يمكن استخدام معظم الغرف البيئية التجارية على سطح المسرح لتصوير SRS بسبب سمكها الكبير مع غطاء زجاجي صلب. تصف هذه الورقة تصميم وتصنيع غرفة مرنة يمكن استخدامها لتصوير الخلايا الحية بفاصل زمني مع اكتشاف إشارة SRS المرسلة على إطار مجهر مستقيم. يتم تحقيق مرونة الغرفة باستخدام مادة ناعمة – فيلم مطاطي طبيعي رقيق. يمكن إضافة العلبة الجديدة وتصميم الغرفة بسهولة إلى إعداد تصوير SRS الحالي. تظهر الاختبارات والنتائج الأولية أن نظام الغرفة المرنة يتيح تصوير SRS مستقرا وطويل الأجل بفاصل زمني للخلايا الحية ، والذي يمكن استخدامه في تطبيقات التصوير الحيوي المختلفة في المستقبل.
يستخدم الفحص المجهري الضوئي لمراقبة الهياكل المجهرية للعينات. التصوير البصري سريع وأقل توغلا وأقل تدميرا من التقنيات الأخرى1. تم تطوير تصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر الضوئي لالتقاط ديناميكيات الخلايا الحية المستزرعة على مدى فترةطويلة 2. توفر الأنواع المختلفة من التباينات الضوئية معلومات مميزة عن العينات البيولوجية. على سبيل المثال ، يظهر الفحص المجهري للطور البصري الاختلاف الدقيق في مؤشرات الانكسار عبر العينة3. يستخدم الفحص المجهري الفلوري على نطاق واسع لتصوير جزيئات حيوية أو عضيات خلوية محددة. ومع ذلك ، فإن أطياف الإثارة والانبعاث ذات النطاق العريض للتألق عادة ما تؤدي إلى تداخل طيفي عند إجراء تصوير متعدد الألوان4. جزيئات الفلورسنت حساسة للضوء ويمكن تبييضها بعد التعرض للضوء الدوري طويل الأمد. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي وضع العلامات الفلورية إلى تغيير التوزيع الحيوي للجزيئات في الخلايا5. الفحص المجهري SRS هو تقنية تصوير كيميائي خالية من الملصقات6. يعتمد تباين SRS على الانتقال الاهتزازي لروابط كيميائية محددة. غالبا ما يظهر التردد الاهتزازي لرابطة كيميائية عرض نطاق طيفي ضيق ، مما يجعل من الممكن تصوير نطاقات رامان متعددة في نفس العينات7. يعد الفحص المجهري SRS أداة فريدة لتصوير الخلايا الحية ، حيث يوفر تباينات كيميائية متعددة بطريقة خالية من الملصقات8.
بينما تم استخدام تصوير SRS للخلايا غير الملوثة في العديد من الدراسات ، لم يتم اعتماد تصوير SRS طويل المدى للخلايا الحية على نطاق واسع. أحد الأسباب هو أنه لا يمكن استخدام الغرف التجارية المفتوحة مباشرة لتصوير SRS بسبب سمكها الكبير9،10،11،12. تم تصميم هذه الغرف ذات الغطاء الزجاجي في الغالب للتصوير الساطع أو التصوير الفلوري باستخدام هدف NA مرتفع واحد مع مخطط الكشف الخلفي. ومع ذلك ، يفضل تصوير SRS الكشف المرسل باستخدام كل من هدف NA العالي ومكثف NA العالي ، والذي يترك فجوة قصيرة جدا (عادة بضعة ملليمترات) بين الهدف والمكثف. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتصميم غرفة مرنة باستخدام مادة ناعمة لتمكين تصوير SRS بفاصل زمني للخلايا الحية باستخدام إطار مجهر مستقيم. في هذا التصميم ، تم وضع هدف غمس الماء في الغرفة الناعمة ويمكن أن يتحرك بحرية في ثلاثة أبعاد لأغراض التركيز والتصوير.
درجة الحرارة المثلى لزراعة معظم خلايا الثدييات هي 37 درجة مئوية ، في حين أن درجة حرارة الغرفة دائما أقل بمقدار 10 درجات من ذلك. درجة الحرارة أعلى أو أقل من 37 درجة مئوية لها تأثير كبير على معدل نمو الخلايا13. لذلك ، يلزم التحكم في درجة حرارة بيئة زراعة الخلايا في نظام تصوير الخلايا الحية. من المعروف أن عدم استقرار درجة الحرارة سيؤدي إلى مشاكل في إلغاء التركيز أثناء التصوير طويل المدى14. لتحقيق بيئة مستقرة تبلغ 37 درجة مئوية ، قمنا ببناء غرفة حاوية كبيرة لتغطية إطار المجهر بالكامل ، بما في ذلك طبقة عازلة للحرارة أسفل المجهر (الشكل 1). داخل غرفة التحكم في درجة الحرارة الكبيرة ، تساعد الغرفة المرنة الصغيرة في الحفاظ بدقة على الرطوبة الفسيولوجية ودرجة الحموضة عبر تدفق الهواء المنظم المكمل ب 5٪ CO 2 (الشكل 2). تم قياس درجة حرارة ورطوبة الغرف للتأكد من أن تصميم الغرفة المزدوجة يوفر حالة زراعة الخلايا المثلى لنمو الخلايا تحت تصوير SRS الدوري طويل المدى (الشكل 3). ثم أظهرنا تطبيق النظام لتصوير الفاصل الزمني وتتبع قطرات الدهون (LDs) في الخلايا السرطانية SKOV3 (الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6).
يعد الفحص المجهري SRS ذو الخلايا الحية ذات الفاصل الزمني تقنية تصوير بديلة لتتبع الجزيئات بطريقة خالية من الملصقات. بالمقارنة مع وضع العلامات الفلورية ، فإن تصوير SRS خال من التبييض الضوئي ، مما يتيح مراقبة الجزيئات على المدى الطويل. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن نظام التصوير بالخلايا الحية على مج…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر فريق التصميم الجامعي لعام 2019 (سوك تشول يون ، وإيان فوكستون ، ولويس مازا ، وجيمس والش) في جامعة بينغهامتون على تصميم وتصنيع واختبار صندوق حاوية المجهر. نشكر سكوت هانكوك وأولغا بتروفا وفابيولا مورينو أوليفاس في جامعة بينغهامتون على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R15GM140444.
A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
Materials and parts for the Flexible chamber | |||
Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
Software | |||
MATLAB | MathWorks | ||
ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
Materials for live-cell imaging | |||
Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |