उत्तेजित रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी के साथ टाइम-लैप्स लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक लचीला कक्ष
Summary
हम संचारित सिग्नल डिटेक्शन के साथ सीधे उत्तेजित रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं के टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक स्टेज-टॉप, लचीले पर्यावरण कक्ष की रिपोर्ट करते हैं। लिपिड बूंदों को 3 मिनट के समय अंतराल के साथ 24 घंटे तक ओलिक एसिड के साथ इलाज किए गए स्कोव 3 कोशिकाओं में चित्रित किया गया था।
Abstract
उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी एक लेबल-मुक्त रासायनिक इमेजिंग तकनीक है। एसआरएस के साथ लाइव-सेल इमेजिंग कई जैविक और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए प्रदर्शित किया गया है। हालांकि, जीवित कोशिकाओं की दीर्घकालिक समय-चूक एसआरएस इमेजिंग को व्यापक रूप से अपनाया नहीं गया है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी अक्सर उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करने के लिए एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) जल-विसर्जन उद्देश्य और एक उच्च एनए तेल-विसर्जन कंडेनसर का उपयोग करता है। इस मामले में, उद्देश्य और कंडेनसर के बीच का अंतर केवल कुछ मिलीमीटर है। इसलिए, अधिकांश वाणिज्यिक चरण-शीर्ष पर्यावरण कक्षों का उपयोग एसआरएस इमेजिंग के लिए नहीं किया जा सकता है क्योंकि उनकी बड़ी मोटाई एक कठोर ग्लास कवर के साथ है। यह पेपर एक लचीले कक्ष के डिजाइन और निर्माण का वर्णन करता है जिसका उपयोग एक ईमानदार माइक्रोस्कोप फ्रेम पर प्रेषित एसआरएस सिग्नल डिटेक्शन के साथ टाइम-लैप्स लाइव-सेल इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। कक्ष का लचीलापन एक नरम सामग्री का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है – एक पतली प्राकृतिक रबर फिल्म। नए बाड़े और कक्ष डिजाइन को आसानी से मौजूदा एसआरएस इमेजिंग सेटअप में जोड़ा जा सकता है। परीक्षण और प्रारंभिक परिणामों से पता चलता है कि लचीली कक्ष प्रणाली जीवित कोशिकाओं के स्थिर, दीर्घकालिक, समय-चूक एसआरएस इमेजिंग को सक्षम बनाती है, जिसका उपयोग भविष्य में विभिन्न बायोइमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।
Introduction
ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग नमूनों के माइक्रोस्ट्रक्चर का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है। ऑप्टिकल इमेजिंगअन्य प्रौद्योगिकियों की तुलना में तेजी से, कम आक्रामक और कम विनाशकारी है। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ लाइव-सेल इमेजिंग कोलंबी अवधि में सुसंस्कृत जीवित कोशिकाओं की गतिशीलता को पकड़ने के लिए विकसित किया गया है। विभिन्न प्रकार के ऑप्टिकल विरोधाभास जैविक नमूनों के बारे में अलग-अलग जानकारी प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, ऑप्टिकल चरण माइक्रोस्कोपी नमूना3 में अपवर्तक सूचकांक ों में सूक्ष्म अंतर को दर्शाता है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से विशिष्ट बायोमोलेक्यूल्स या सेलुलर ऑर्गेनेल की छवि बनाने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, फ्लोरेसेंस के ब्रॉडबैंड उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के परिणामस्वरूप आमतौर पर वर्णक्रमीय ओवरलैपिंग होती है जब मल्टीकलरइमेजिंग की जाती है। फ्लोरोसेंट अणु प्रकाश-संवेदनशील होते हैं और लंबे समय तक, आवधिक प्रकाश जोखिम के बाद ब्लीच किए जा सकते हैं। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति लेबलिंग कोशिकाओं में अणुओं के जैव वितरण को बदल सकतीहै। एसआरएस माइक्रोस्कोपी एक लेबल-मुक्त रासायनिक इमेजिंग तकनीकहै। एसआरएस का विपरीत विशिष्ट रासायनिक बंधों के कंपन संक्रमण पर निर्भर करता है। एक रासायनिक बंधन की कंपन आवृत्ति अक्सर एक संकीर्ण वर्णक्रमीय बैंडविड्थ प्रदर्शित करती है, जिससे एकही नमूने में कई रमन बैंड की छवि बनाना संभव हो जाता है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक अनूठा उपकरण है, जो लेबल-मुक्ततरीके से कई रासायनिक विरोधाभास प्रदान करता है।
जबकि बिना दाग वाली कोशिकाओं की एसआरएस इमेजिंग का उपयोग कई अध्ययनों के लिए किया गया है, जीवित कोशिकाओं की दीर्घकालिक समय-चूक एसआरएस इमेजिंग को व्यापक रूप से अपनाया नहीं गया है। एक कारण यह है कि वाणिज्यिक खुले कक्षों को उनकी बड़ी मोटाई9,10,11,12 के कारण एसआरएस इमेजिंग के लिए सीधे उपयोग नहीं किया जा सकता है। ग्लास ढक्कन वाले इन कक्षों को ज्यादातर एक बैकवर्ड डिटेक्शन स्कीम के साथ एकल उच्च एनए उद्देश्य का उपयोग करके ब्राइटफील्ड या फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, एसआरएस इमेजिंग एक उच्च एनए उद्देश्य और उच्च एनए कंडेनसर दोनों का उपयोग करके प्रेषित पहचान पसंद करता है, जो उद्देश्य और कंडेनसर के बीच केवल एक बहुत कम अंतर (आमतौर पर कुछ मिलीमीटर) छोड़ देता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने एक ईमानदार माइक्रोस्कोप फ्रेम का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं के टाइम-लैप्स एसआरएस इमेजिंग को सक्षम करने के लिए एक नरम सामग्री का उपयोग करके एक लचीला कक्ष तैयार किया। इस डिजाइन में, पानी को डुबोने के उद्देश्य को नरम कक्ष में संलग्न किया गया था और ध्यान केंद्रित करने और इमेजिंग उद्देश्यों के लिए तीन आयामों में स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ सकता है।
अधिकांश स्तनधारी कोशिकाओं के संवर्धन के लिए इष्टतम तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है, जबकि कमरे का तापमान हमेशा इससे 10 डिग्री कम होता है। 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक या कम तापमान सेल वृद्धि दर13 पर नाटकीय प्रभाव डालता है। इसलिए, लाइव-सेल इमेजिंग सिस्टम में सेल कल्चर वातावरण का तापमान नियंत्रण आवश्यक है। यह ज्ञात है कि तापमान अस्थिरता दीर्घकालिक इमेजिंग14 के दौरान डीफोकसिंग मुद्दों को जन्म देगी। एक स्थिर 37 डिग्री सेल्सियस वातावरण प्राप्त करने के लिए, हमने पूरे माइक्रोस्कोप फ्रेम को कवर करने के लिए एक बड़ा बाड़े कक्ष बनाया, जिसमें माइक्रोस्कोप के नीचे एक थर्मल इन्सुलेशन परत शामिल है (चित्रा 1)। बड़े तापमान नियंत्रण कक्ष के भीतर, छोटा लचीला कक्ष 5% सीओ 2 (चित्रा 2) के साथ पूरक विनियमित वायु प्रवाह के माध्यम से शारीरिक आर्द्रता और पीएच को सटीक रूप से बनाए रखने में मदद करता है। कक्षों के तापमान और आर्द्रता को यह पुष्टि करने के लिए मापा गया था कि डबल-चैंबर डिजाइन ने दीर्घकालिक, आवधिक एसआरएस इमेजिंग (चित्रा 3) के तहत सेल विकास के लिए इष्टतम सेल कल्चर स्थिति प्रदान की है। फिर हमने स्कोव 3 कैंसर कोशिकाओं (चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6) में टाइम-लैप्स इमेजिंग और लिपिड बूंदों (एलडी) को ट्रैक करने के लिए सिस्टम के आवेदन का प्रदर्शन किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
टाइम-लैप्स लाइव-सेल एसआरएस माइक्रोस्कोपी लेबल-फ्री तरीके से अणु ट्रैकिंग के लिए एक वैकल्पिक इमेजिंग तकनीक है। प्रतिदीप्ति लेबलिंग की तुलना में, एसआरएस इमेजिंग फोटोब्लीचिंग से मुक्त है, जिससे अणुओं क…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम माइक्रोस्कोप बाड़े के बॉक्स के डिजाइन, निर्माण और परीक्षण के लिए बिंघमटन विश्वविद्यालय में 2019 अंडरग्रेजुएट सीनियर डिज़ाइन टीम (सुक चुल यून, इयान फॉक्सटन, लुई माज़ा और जेम्स वाल्श) को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम सहायक चर्चाओं के लिए बिंघमटन विश्वविद्यालय में स्कॉट हैनकॉक, ओल्गा पेत्रोवा और फैबिओला मोरेनो ओलिवास को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को पुरस्कार संख्या आर 15 जीएम 140444 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
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