Una camera flessibile per l'imaging di cellule vive time-lapse con microscopia a diffusione Raman stimolata
Summary
Riportiamo una camera ambientale flessibile per l’imaging time-lapse di cellule vive utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata verticalmente con rilevamento del segnale trasmesso. Le goccioline lipidiche sono state visualizzate in cellule SKOV3 trattate con acido oleico per un massimo di 24 ore con un intervallo di tempo di 3 minuti.
Abstract
La microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS) è una tecnologia di imaging chimico label-free. L’imaging di cellule vive con SRS è stato dimostrato per molte applicazioni biologiche e biomediche. Tuttavia, l’imaging SRS time-lapse a lungo termine delle cellule vive non è stato ampiamente adottato. La microscopia SRS utilizza spesso un obiettivo ad immersione in acqua ad alta apertura numerica (NA) e un condensatore ad alta immersione in olio NA per ottenere immagini ad alta risoluzione. In questo caso, lo spazio tra l’obiettivo e il condensatore è solo di pochi millimetri. Pertanto, la maggior parte delle camere ambientali da palcoscenico commerciali non può essere utilizzata per l’imaging SRS a causa del loro grande spessore con una copertura di vetro rigido. Questo documento descrive la progettazione e la fabbricazione di una camera flessibile che può essere utilizzata per l’imaging di cellule vive time-lapse con rilevamento del segnale SRS trasmesso su un telaio del microscopio verticale. La flessibilità della camera si ottiene utilizzando un materiale morbido – un sottile film di gomma naturale. Il nuovo design dell’involucro e della camera può essere facilmente aggiunto a una configurazione di imaging SRS esistente. I test e i risultati preliminari dimostrano che il sistema a camera flessibile consente l’imaging SRS stabile, a lungo termine, time-lapse di cellule vive, che può essere utilizzato per varie applicazioni di bioimaging in futuro.
Introduction
La microscopia ottica viene utilizzata per osservare le microstrutture dei campioni. L’imaging ottico è rapido, meno invasivo e meno distruttivo di altre tecnologie1. L’imaging delle cellule vive con microscopia ottica è sviluppato per catturare la dinamica delle cellule vive in coltura per un lungo periodo2. Diversi tipi di contrasti ottici forniscono informazioni distinte sui campioni biologici. Ad esempio, la microscopia ottica di fase mostra la sottile differenza negli indici di rifrazione nel campione3. La microscopia a fluorescenza è ampiamente utilizzata per visualizzare specifiche biomolecole o organelli cellulari. Tuttavia, gli spettri di eccitazione a banda larga e di emissione della fluorescenza di solito provocano sovrapposizioni spettrali quando viene eseguita l’imaging multicolore4. Le molecole fluorescenti sono sensibili alla luce e possono essere sbiancate dopo un’esposizione periodica alla luce a lungo termine. Inoltre, la marcatura a fluorescenza può modificare la biodistribuzione delle molecole nelle cellule5. La microscopia SRS è una tecnologia di imaging chimico label-free6. Il contrasto di SRS si basa sulla transizione vibrazionale di specifici legami chimici. La frequenza vibrazionale di un legame chimico spesso mostra una larghezza di banda spettrale ristretta, rendendo possibile l’immagine di più bande Raman negli stessi campioni7. La microscopia SRS è uno strumento unico per l’imaging di cellule vive, che fornisce molteplici contrasti chimici in modo label-free8.
Mentre l’imaging SRS di cellule non colorate è stato utilizzato per molti studi, l’imaging SRS time-lapse a lungo termine di cellule vive non è stato ampiamente adottato. Uno dei motivi è che le camere aperte commerciali non possono essere utilizzate direttamente per l’imaging SRS a causa del loro grande spessore 9,10,11,12. Queste camere con coperchio in vetro sono per lo più progettate per l’imaging in campo chiaro o a fluorescenza utilizzando un singolo obiettivo ad alto NA con uno schema di rilevamento all’indietro. Tuttavia, l’imaging SRS preferisce il rilevamento trasmesso utilizzando sia un obiettivo NA elevato che un condensatore ad alto NA, che lascia solo uno spazio molto breve (in genere pochi millimetri) tra l’obiettivo e il condensatore. Per ovviare a questo problema, abbiamo progettato una camera flessibile utilizzando un materiale morbido per consentire l’imaging SRS time-lapse di cellule vive utilizzando una cornice per microscopio verticale. In questo progetto, l’obiettivo di immersione dell’acqua è stato racchiuso nella camera morbida e può muoversi liberamente in tre dimensioni per scopi di messa a fuoco e imaging.
La temperatura ottimale per la coltura della maggior parte delle cellule di mammifero è di 37 °C, mentre la temperatura ambiente è sempre inferiore di 10°. Una temperatura superiore o inferiore a 37 °C ha un effetto drammatico sul tasso di crescita cellulare13. Pertanto, il controllo della temperatura dell’ambiente di coltura cellulare è richiesto in un sistema di imaging di cellule vive. È noto che l’instabilità della temperatura porterà a problemi di sfocatura durante l’imaging a lungo termine14. Per ottenere un ambiente stabile a 37 °C, abbiamo costruito una grande camera di custodia per coprire l’intera struttura del microscopio, incluso uno strato di isolamento termico sotto il microscopio (Figura 1). All’interno della camera di controllo della temperatura di grandi dimensioni, la piccola camera flessibile aiuta a mantenere con precisione l’umidità fisiologica e il pH attraverso il flusso d’aria regolato integrato con il 5% di CO 2 (Figura 2). La temperatura e l’umidità delle camere sono state misurate per confermare che il design a doppia camera forniva la condizione ottimale di coltura cellulare per la crescita cellulare nell’imaging SRS periodico a lungo termine (Figura 3). Abbiamo quindi dimostrato l’applicazione del sistema per l’imaging time-lapse e il monitoraggio delle goccioline lipidiche (LD) nelle cellule tumorali SKOV3 (Figura 4, Figura 5 e Figura 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopia SRS a cellule vive time-lapse è una tecnica di imaging alternativa per il tracciamento delle molecole in modo label-free. Rispetto alla marcatura a fluorescenza, l’imaging SRS è privo di fotosbiancamento, consentendo il monitoraggio a lungo termine delle molecole. Tuttavia, ad oggi, il sistema di imaging di cellule vive su una microscopia SRS verticale non è disponibile in commercio. In questo lavoro, è stato sviluppato un sistema di imaging di cellule vive con una scatola stabile per microscopio isola…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vogliamo ringraziare il 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza e James Walsh) presso la Binghamton University per la progettazione, la fabbricazione e il collaudo della scatola di custodia del microscopio. Ringraziamo Scott Hancock, Olga Petrova e Fabiola Moreno Olivas della Binghamton University per le utili discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health con il numero di premio R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
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