자극 라만 산란 현미경을 사용한 타임랩스 라이브 셀 이미징을 위한 유연한 챔버
Summary
우리는 전송된 신호 감지 기능이 있는 직립 자극 라만 산란 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 타임랩스 이미징을 위한 무대 상단의 유연한 환경 챔버를 보고합니다. 지질 방울은 3분 시간 간격으로 최대 24시간 동안 올레산으로 처리된 SKOV3 세포에서 이미지화되었습니다.
Abstract
자극 라만 산란(SRS) 현미경은 라벨이 필요 없는 화학 이미징 기술입니다. SRS를 사용한 생세포 이미징은 많은 생물학적 및 생물 의학 응용 분야에서 입증되었습니다. 그러나, 살아있는 세포의 장기 타임랩스 SRS 이미징은 널리 채택되지 않았다. SRS 현미경은 고해상도 이미징을 달성하기 위해 높은 개구수(NA) 침수 대물렌즈와 높은 NA 오일 이멀젼 콘덴서를 사용하는 경우가 많습니다. 이 경우 대물렌즈와 콘덴서 사이의 간격은 몇 밀리미터에 불과합니다. 그러므로, 대부분의 상업적인 단계 정상 환경 약실은 단단한 유리제 덮개를 가진 그들의 큰 간격 때문에 SRS 화상 진찰을 위해 이용될 수 없습니다. 이 백서는 정립 현미경 프레임에서 전송된 SRS 신호 감지를 통해 타임랩스 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있는 유연한 챔버의 설계 및 제작에 대해 설명합니다. 챔버의 유연성은 얇은 천연 고무 필름 인 부드러운 소재를 사용하여 달성됩니다. 새로운 인클로저 및 챔버 설계는 기존 SRS 이미징 설정에 쉽게 추가할 수 있습니다. 테스트 및 예비 결과는 플렉서블 챔버 시스템이 향후 다양한 바이오이미징 애플리케이션에 사용될 수 있는 살아있는 세포의 안정적이고 장기적인 타임랩스 SRS 이미징을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.
Introduction
광학 현미경은 샘플의 미세 구조를 관찰하는 데 사용됩니다. 광학 이미징은 다른 기술보다 빠르고, 덜 침습적이며, 덜 파괴적입니다1. 광학 현미경을 이용한 생세포 이미징은 장기간에 걸쳐 배양된 생세포의 역학을 포착하기 위해 개발되었다2. 다양한 유형의 광학 대비는 생물학적 샘플에 대한 뚜렷한 정보를 제공합니다. 예를 들어, 광학 위상 현미경은 샘플3에 걸친 굴절률의 미묘한 차이를 보여줍니다. 형광 현미경은 특정 생체 분자 또는 세포 소기관을 이미지화하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, 형광의 광대역 여기 및 방출 스펙트럼은 일반적으로 다색 이미징이 수행될 때 스펙트럼 중첩을 초래한다4. 형광 분자는 빛에 민감하며 장기적이고 주기적으로 빛에 노출되면 표백될 수 있습니다. 또한, 형광 표지는 세포 내 분자의 생체 분포를 변화시킬 수 있다5. SRS 현미경은 무표지 화학 이미징 기술입니다6. SRS의 대비는 특정 화학 결합의 진동 전이에 의존합니다. 화학 결합의 진동 주파수는 종종 좁은 스펙트럼 대역폭을 나타내므로 동일한 샘플에서 여러 라만 대역을 이미지화하는 것이 가능합니다7. SRS 현미경은 살아있는 세포 이미징을 위한 고유한 도구로, 라벨 없는 방식으로 여러 화학적 대조를 제공합니다8.
염색되지 않은 세포의 SRS 이미징은 많은 연구에 사용되었지만 살아있는 세포의 장기 타임랩스 SRS 이미징은 널리 채택되지 않았습니다. 한 가지 이유는 상업용 개방형 챔버가 두께9,10,11,12의 크기 때문에 SRS 이미징에 직접 사용할 수 없기 때문입니다. 유리 뚜껑이 있는 이 챔버는 대부분 역방향 검출 체계와 함께 단일 높은 NA 대물렌즈를 사용하는 명시야 또는 형광 이미징을 위해 설계되었습니다. 그러나, SRS 이미징은 높은 NA 대물렌즈와 높은 NA 콘덴서를 모두 사용하는 송신 검출을 선호하며, 이는 대물렌즈와 콘덴서 사이에 매우 짧은 갭(전형적으로 수 밀리미터)만을 남긴다. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 직립 현미경 프레임을 사용하여 살아있는 세포의 타임랩스 SRS 이미징을 가능하게 하는 부드러운 재료를 사용하여 유연한 챔버를 설계했습니다. 이 설계에서 침수 대물렌즈는 소프트 챔버에 둘러싸여 있으며 초점 및 이미징 목적을 위해 3차원으로 자유롭게 이동할 수 있습니다.
대부분의 포유류 세포를 배양하기 위한 최적의 온도는 37°C인 반면 실온은 항상 이보다 10° 낮습니다. 37°C보다 높거나 낮은 온도는 세포 성장률에 극적인 영향을 미친다13. 따라서 생세포 이미징 시스템에서는 세포 배양 환경의 온도 제어가 필요합니다. 온도 불안정은 장시간 이미징 중에 초점 흐림으로 이어지는 것으로 알려져 있다14. 안정적인 37°C 환경을 달성하기 위해 현미경 아래의 단열층을 포함하여 전체 현미경 프레임을 덮을 수 있는 대형 인클로저 챔버를 구축했습니다(그림 1). 크기가 큰 온도 제어 챔버 내에서 작고 유연한 챔버는 5%CO2로 보충된 조절된 공기 흐름을 통해 생리학적 습도와 pH를 정확하게 유지하는 데 도움이 됩니다(그림 2). 챔버의 온도 및 습도를 측정하여 이중 챔버 설계가 장기적이고 주기적인 SRS 이미징 하에서 세포 성장을 위한 최적의 세포 배양 조건을 제공하는지 확인했습니다(그림 3). 그런 다음 SKOV3 암세포에서 시간 경과 이미징 및 지질 방울(LD) 추적을 위한 시스템의 적용을 시연했습니다(그림 4, 그림 5 및 그림 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
타임랩스 라이브 셀 SRS 현미경은 라벨 없는 방식으로 분자 추적을 위한 대체 이미징 기술입니다. 형광 표지와 비교하여 SRS 이미징은 광표백이 없어 분자를 장기간 모니터링할 수 있습니다. 그러나, 현재까지, 직립 SRS 현미경 상의 라이브 세포 이미징 시스템은 상업적으로 이용가능하지 않다. 이 작업에서는 안정적인 단열 현미경 인클로저 상자와 유연한 내부 소프트 챔버가 있는 라이브 셀 이미징…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
현미경 인클로저 상자의 설계, 제작 및 테스트에 대해 Binghamton University의 2019년 학부 수석 디자인 팀(윤석철, Ian Foxton, Louis Mazza 및 James Walsh)에게 감사드립니다. 도움이 되는 토론을 해주신 Binghamton University의 Scott Hancock, Olga Petrova, Fabiola Moreno Olivas에게 감사드립니다. 이 연구는 수상 번호 R15GM140444에 따라 국립 보건원(National Institutes of Health)의 지원을 받았습니다.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
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