Et fleksibelt kammer for time-lapse live-celleavbildning med stimulert Raman-spredningsmikroskopi
Summary
Vi rapporterer et trinn-topp, fleksibelt miljøkammer for time-lapse-avbildning av levende celler ved hjelp av oppreist stimulert Raman-spredningsmikroskopi med overført signaldeteksjon. Lipiddråper ble avbildet i SKOV3-celler behandlet med oljesyre i opptil 24 timer med 3 minutters tidsintervall.
Abstract
Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi er en etikettfri kjemisk bildebehandlingsteknologi. Levende celleavbildning med SRS har blitt demonstrert for mange biologiske og biomedisinske applikasjoner. Imidlertid har langsiktig time-lapse SRS-avbildning av levende celler ikke blitt mye vedtatt. SRS-mikroskopi bruker ofte et høyt numerisk blenderåpning (NA) vann-nedsenkingsmål og en høy NA olje-nedsenkingskondensator for å oppnå høyoppløselig avbildning. I dette tilfellet er gapet mellom målet og kondensatoren bare noen få millimeter. Derfor kan de fleste kommersielle scene-topp miljøkamre ikke brukes til SRS-avbildning på grunn av deres store tykkelse med et stivt glassdeksel. Dette papiret beskriver design og fabrikasjon av et fleksibelt kammer som kan brukes til time-lapse live-celleavbildning med overført SRS-signaldeteksjon på en oppreist mikroskopramme. Kammerets fleksibilitet oppnås ved å bruke et mykt materiale – en tynn naturgummifilm. Det nye kabinettet og kammerdesignet kan enkelt legges til et eksisterende SRS-bildeoppsett. Testingen og foreløpige resultater viser at det fleksible kammersystemet muliggjør stabil, langsiktig, time-lapse SRS-avbildning av levende celler, som kan brukes til ulike bioimaging-applikasjoner i fremtiden.
Introduction
Optisk mikroskopi brukes til å observere mikrostrukturer av prøver. Optisk bildebehandling er rask, mindre invasiv og mindre ødeleggende enn andre teknologier1. Levende celleavbildning med optisk mikroskopi er utviklet for å fange dynamikken til dyrkede levende celler over en lang periode2. Ulike typer optiske kontraster gir tydelig informasjon om biologiske prøver. For eksempel viser optisk fasemikroskopi den subtile forskjellen i brytningsindeksene over prøven3. Fluorescensmikroskopi er mye brukt til å avbilde spesifikke biomolekyler eller cellulære organeller. Imidlertid resulterer bredbåndseksitasjon og emisjonsspektra av fluorescens vanligvis i spektral overlapping når flerfarget avbildning utføres4. Fluorescerende molekyler er lysfølsomme og kan blekes etter langvarig, periodisk lyseksponering. I tillegg kan fluorescensmerking endre biofordelingen av molekylene i celler5. SRS-mikroskopi er en merkefri kjemisk bildebehandlingsteknologi6. Kontrasten til SRS er avhengig av vibrasjonsovergangen til spesifikke kjemiske bindinger. Vibrasjonsfrekvensen til en kjemisk binding viser ofte en smal spektral båndbredde, noe som gjør det mulig å avbilde flere Raman-bånd i de samme prøvene7. SRS-mikroskopi er et unikt verktøy for levende celleavbildning, og gir flere kjemiske kontraster på en etikettfri måte8.
Mens SRS-avbildning av ufargede celler har blitt brukt i mange studier, har langsiktig time-lapse SRS-avbildning av levende celler ikke blitt mye vedtatt. En grunn er at kommersielle åpne kamre ikke kan brukes direkte til SRS-avbildning på grunn av deres store tykkelse 9,10,11,12. Disse kamrene med glasslokk er for det meste designet for lysfelt- eller fluorescensavbildning ved bruk av et enkelt høyt NA-objektiv med et bakoverdeteksjonsskjema. SRS-avbildning foretrekker imidlertid overført deteksjon ved bruk av både et høyt NA-mål og en høy NA-kondensator, noe som bare etterlater et veldig kort gap (vanligvis noen få millimeter) mellom målet og kondensatoren. For å overvinne dette problemet designet vi et fleksibelt kammer ved hjelp av et mykt materiale for å muliggjøre time-lapse SRS-avbildning av levende celler ved hjelp av en oppreist mikroskopramme. I dette designet ble vanndyppemålet innelukket i det myke kammeret og kan fritt bevege seg i tre dimensjoner for fokusering og avbildning.
Den optimale temperaturen for dyrking av de fleste pattedyrceller er 37 °C, mens romtemperaturen alltid er 10° lavere enn dette. Temperatur høyere eller lavere enn 37 °C har en dramatisk effekt på celleveksthastigheten13. Derfor er temperaturkontroll av cellekulturmiljøet nødvendig i et levende cellebildesystem. Det er kjent at temperaturstabilitet vil føre til defokuseringsproblemer under langsiktig avbildning14. For å oppnå et stabilt miljø på 37 °C bygde vi et stort kapslingskammer for å dekke hele mikroskoprammen, inkludert et varmeisolerende lag under mikroskopet (figur 1). Innenfor det store temperaturkontrollkammeret bidrar det lille fleksible kammeret til å opprettholde den fysiologiske fuktigheten og pH-verdien nøyaktig via den regulerte luftstrømmen supplert med 5 % CO 2 (figur 2). Temperatur og luftfuktighet i kamrene ble målt for å bekrefte at dobbeltkammerdesignet ga optimal cellekulturtilstand for cellevekst under langvarig, periodisk SRS-avbildning (figur 3). Deretter demonstrerte vi anvendelsen av systemet for time-lapse-avbildning og sporing av lipiddråper (LD) i SKOV3-kreftceller (figur 4, figur 5 og figur 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse live-cell SRS-mikroskopi er en alternativ bildebehandlingsteknikk for molekylsporing på en etikettfri måte. Sammenlignet med fluorescensmerking er SRS-avbildning fri for fotobleking, noe som muliggjør langsiktig overvåking av molekyler. Men til dags dato er levende cellebildesystem på en oppreist SRS-mikroskopi ikke kommersielt tilgjengelig. I dette arbeidet ble det utviklet et levende celleavbildningssystem med en stabil termisk isolert mikroskopkapslingsboks og et fleksibelt indre mykt kammer for å mul…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza og James Walsh) ved Binghamton University for design, fabrikasjon og testing av mikroskopets kabinettboks. Vi takker Scott Hancock, Olga Petrova og Fabiola Moreno Olivas ved Binghamton University for nyttige diskusjoner. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health under tildelingsnummer R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. . Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. . Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R. Live-cell imaging: the cell’s perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
