Una cámara flexible para imágenes de células vivas de lapso de tiempo con microscopía de dispersión Raman estimulada
Summary
Informamos una cámara ambiental flexible en la parte superior de la etapa para obtener imágenes de lapso de tiempo de células vivas utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada vertical con detección de señal transmitida. Se obtuvieron imágenes de gotitas lipídicas en células SKOV3 tratadas con ácido oleico durante un máximo de 24 h con un intervalo de tiempo de 3 minutos.
Abstract
La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imágenes químicas sin etiquetas. Las imágenes de células vivas con SRS se han demostrado para muchas aplicaciones biológicas y biomédicas. Sin embargo, las imágenes SRS de lapso de tiempo a largo plazo de células vivas no se han adoptado ampliamente. La microscopía SRS a menudo utiliza un objetivo de inmersión en agua de alta apertura numérica (NA) y un condensador de inmersión en aceite de alta NA para lograr imágenes de alta resolución. En este caso, el espacio entre el objetivo y el condensador es de solo unos pocos milímetros. Por lo tanto, la mayoría de las cámaras ambientales comerciales de etapa superior no se pueden usar para imágenes SRS debido a su gran grosor con una cubierta de vidrio rígido. Este documento describe el diseño y la fabricación de una cámara flexible que se puede utilizar para imágenes de células vivas de lapso de tiempo con detección de señal SRS transmitida en un marco de microscopio vertical. La flexibilidad de la cámara se logra mediante el uso de un material blando: una película delgada de caucho natural. El nuevo diseño de la carcasa y la cámara se puede agregar fácilmente a una configuración de imágenes SRS existente. Las pruebas y los resultados preliminares demuestran que el sistema de cámara flexible permite obtener imágenes SRS estables, a largo plazo y de lapso de tiempo de células vivas, que se pueden utilizar para diversas aplicaciones de bioimagen en el futuro.
Introduction
La microscopía óptica se utiliza para observar las microestructuras de las muestras. La imagen óptica es rápida, menos invasiva y menos destructiva que otras tecnologías1. La obtención de imágenes de células vivas con microscopía óptica se desarrolla para capturar la dinámica de células vivas cultivadas durante un largo período2. Los diferentes tipos de contrastes ópticos proporcionan información distinta sobre las muestras biológicas. Por ejemplo, la microscopía óptica de fase muestra la sutil diferencia en los índices de refracción en la muestra3. La microscopía de fluorescencia se usa ampliamente para obtener imágenes de biomoléculas específicas u orgánulos celulares. Sin embargo, los espectros de excitación y emisión de banda ancha de fluorescencia generalmente resultan en superposición espectral cuando se realizan imágenes multicolor4. Las moléculas fluorescentes son sensibles a la luz y pueden blanquearse después de una exposición periódica a la luz a largo plazo. Además, el etiquetado de fluorescencia puede cambiar la biodistribución de las moléculas en las células5. La microscopía SRS es una tecnología de imagen química sin etiquetas6. El contraste de SRS se basa en la transición vibracional de enlaces químicos específicos. La frecuencia vibratoria de un enlace químico a menudo exhibe un ancho de banda espectral estrecho, lo que hace factible obtener imágenes de múltiples bandas Raman en las mismas muestras7. La microscopía SRS es una herramienta única para la obtención de imágenes de células vivas, que proporciona múltiples contrastes químicos sin etiquetas8.
Si bien las imágenes SRS de células no teñidas se han utilizado para muchos estudios, las imágenes SRS de lapso de tiempo a largo plazo de células vivas no se han adoptado ampliamente. Una razón es que las cámaras abiertas comerciales no se pueden usar directamente para imágenes SRS debido a su gran espesor 9,10,11,12. Estas cámaras con una tapa de vidrio están diseñadas principalmente para imágenes de campo claro o fluorescencia utilizando un solo objetivo de alta NA con un esquema de detección hacia atrás. Sin embargo, las imágenes SRS prefieren la detección transmitida utilizando tanto un objetivo de alta NA como un condensador de alta NA, lo que deja solo un espacio muy corto (generalmente unos pocos milímetros) entre el objetivo y el condensador. Para superar este problema, diseñamos una cámara flexible utilizando un material blando para permitir la obtención de imágenes SRS de lapso de tiempo de células vivas utilizando un marco de microscopio vertical. En este diseño, el objetivo de inmersión de agua estaba encerrado en la cámara blanda y puede moverse libremente en tres dimensiones para fines de enfoque e imagen.
La temperatura óptima para cultivar la mayoría de las células de mamíferos es de 37 ° C, mientras que la temperatura ambiente es siempre 10 ° más baja que esto. Una temperatura superior o inferior a 37 °C tiene un efecto dramático en la tasa de crecimiento celular13. Por lo tanto, se requiere el control de la temperatura del entorno de cultivo celular en un sistema de imágenes de células vivas. Se sabe que la inestabilidad de la temperatura dará lugar a problemas de desenfoque durante las imágenes a largo plazo14. Para lograr un entorno estable de 37 °C, construimos una gran cámara de recinto para cubrir todo el marco del microscopio, incluida una capa de aislamiento térmico debajo del microscopio (Figura 1). Dentro de la cámara de control de temperatura considerable, la pequeña cámara flexible ayuda a mantener con precisión la humedad fisiológica y el pH a través del flujo de aire regulado complementado con 5% deCO2 (Figura 2). La temperatura y la humedad de las cámaras se midieron para confirmar que el diseño de doble cámara proporcionaba la condición óptima de cultivo celular para el crecimiento celular bajo imágenes SRS periódicas a largo plazo (Figura 3). Luego demostramos la aplicación del sistema para imágenes de lapso de tiempo y seguimiento de gotas de lípidos (LD) en células cancerosas SKOV3 (Figura 4, Figura 5 y Figura 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopía SRS de células vivas de lapso de tiempo es una técnica de imagen alternativa para el seguimiento de moléculas sin etiquetas. En comparación con el etiquetado de fluorescencia, las imágenes SRS están libres de fotoblanqueo, lo que permite el monitoreo a largo plazo de las moléculas. Sin embargo, hasta la fecha, el sistema de imágenes de células vivas en una microscopía SRS vertical no está disponible comercialmente. En este trabajo, se desarrolló un sistema de imágenes de células vivas con un…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer al Equipo de Diseño Senior de Pregrado 2019 (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza y James Walsh) de la Universidad de Binghamton por el diseño, fabricación y prueba de la caja de la carcasa del microscopio. Agradecemos a Scott Hancock, Olga Petrova y Fabiola Moreno Olivas de la Universidad de Binghamton por sus útiles discusiones. Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R15GM140444.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. . Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. . Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R. Live-cell imaging: the cell’s perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
