Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobu ile Hızlandırılmış Canlı Hücre Görüntüleme için Esnek Bir Oda
Summary
İletilen sinyal algılamalı dik uyarılmış Raman saçılma mikroskobu kullanılarak canlı hücrelerin hızlandırılmış görüntülenmesi için sahne üstü, esnek bir çevre odası sunuyoruz. Lipid damlacıkları, oleik asit ile muamele edilen SKOV3 hücrelerinde, 3 dakikalık bir zaman aralığıyla 24 saate kadar görüntülendi.
Abstract
Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir. SRS ile canlı hücre görüntüleme, birçok biyolojik ve biyomedikal uygulama için gösterilmiştir. Bununla birlikte, canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi yaygın olarak benimsenmemiştir. SRS mikroskopisi genellikle yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için yüksek sayısal açıklıklı (NA) suya daldırma hedefi ve yüksek NA yağ daldırma kondenseri kullanır. Bu durumda, amaç ile kondenser arasındaki boşluk sadece birkaç milimetredir. Bu nedenle, çoğu ticari sahne üstü çevre odası, sert bir cam kapaklı büyük kalınlıkları nedeniyle SRS görüntüleme için kullanılamaz. Bu makalede, dik bir mikroskop çerçevesi üzerinde iletilen SRS sinyal tespiti ile hızlandırılmış canlı hücre görüntülemesi için kullanılabilecek esnek bir odanın tasarımı ve üretimi açıklanmaktadır. Odanın esnekliği, yumuşak bir malzeme kullanılarak elde edilir – ince bir doğal kauçuk film. Yeni muhafaza ve bölme tasarımı, mevcut bir SRS görüntüleme kurulumuna kolayca eklenebilir. Test ve ön sonuçlar, esnek oda sisteminin, gelecekte çeşitli biyogörüntüleme uygulamaları için kullanılabilecek canlı hücrelerin kararlı, uzun vadeli, hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağladığını göstermektedir.
Introduction
Optik mikroskopi, örneklerin mikroyapılarını gözlemlemek için kullanılır. Optik görüntüleme hızlı, daha az invaziv ve diğer teknolojilerden daha az yıkıcıdır1. Optik mikroskopi ile canlı hücre görüntüleme, kültürlenmiş canlı hücrelerin dinamiklerini uzun bir süre boyunca yakalamak için geliştirilmiştir2. Farklı optik kontrast türleri, biyolojik örnekler hakkında farklı bilgiler sağlar. Örneğin, optik faz mikroskobu, örnek3 boyunca kırılma indekslerindeki ince farkı gösterir. Floresan mikroskopi, spesifik biyomolekülleri veya hücresel organelleri görüntülemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, floresanın geniş bant uyarımı ve emisyon spektrumları genellikle çok renkli görüntüleme yapıldığında spektral örtüşmeye neden olur4. Floresan molekülleri ışığa duyarlıdır ve uzun süreli, periyodik ışığa maruz kaldıktan sonra ağartılabilir. Ek olarak, floresan etiketleme, hücrelerdeki moleküllerin biyolojik dağılımını değiştirebilir5. SRS mikroskopisi etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir6. SRS’nin kontrastı, belirli kimyasal bağların titreşimsel geçişine dayanır. Bir kimyasal bağın titreşim frekansı genellikle dar bir spektral bant genişliği sergiler ve bu da aynı örneklerde birden fazla Raman bandının görüntülenmesini mümkün kılar7. SRS mikroskopisi, canlı hücre görüntülemesi için benzersiz bir araçtır ve etiketsiz bir şekilde çoklu kimyasal kontrastlar sağlar8.
Boyanmamış hücrelerin SRS görüntülemesi birçok çalışma için kullanılmış olsa da, canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi yaygın olarak benimsenmemiştir. Bunun bir nedeni, ticari açık odaların 9,10,11,12 kalınlıkları nedeniyle SRS görüntüleme için doğrudan kullanılamamasıdır. Cam kapaklı bu odalar çoğunlukla geriye doğru algılama şemasına sahip tek bir yüksek NA hedefi kullanılarak parlak alan veya floresan görüntüleme için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, SRS görüntüleme, hem yüksek NA hedefi hem de yüksek NA kondenseri kullanılarak iletilen algılamayı tercih eder, bu da amaç ile kondenser arasında sadece çok kısa bir boşluk (tipik olarak birkaç milimetre) bırakır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, dik bir mikroskop çerçevesi kullanarak canlı hücrelerin hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağlamak için yumuşak bir malzeme kullanarak esnek bir oda tasarladık. Bu tasarımda, suya daldırma hedefi yumuşak odaya yerleştirilmiştir ve odaklama ve görüntüleme amacıyla üç boyutta serbestçe hareket edebilir.
Çoğu memeli hücresinin kültürlenmesi için en uygun sıcaklık 37 ° C’dir, oda sıcaklığı ise her zaman bundan 10 ° daha düşüktür. 37 ° C’den yüksek veya daha düşük sıcaklık, hücre büyüme hızı üzerinde dramatik bir etkiye sahiptir13. Bu nedenle canlı hücre görüntüleme sisteminde hücre kültürü ortamının sıcaklık kontrolü gereklidir. Sıcaklık kararsızlığının uzun süreli görüntüleme sırasında bulanıklaştırma sorunlarına yol açacağı bilinmektedir14. Kararlı bir 37 °C ortam elde etmek için, mikroskopun altında bir ısı yalıtım tabakası da dahil olmak üzere tüm mikroskop çerçevesini kaplayacak büyük bir muhafaza odası inşa ettik (Şekil 1). Büyük sıcaklık kontrol odası içindeki küçük esnek oda, %5 CO 2 ile desteklenen düzenlenmiş hava akışı yoluyla fizyolojik nemin ve pH’ın doğru bir şekilde korunmasına yardımcı olur (Şekil 2). Odaların sıcaklığı ve nemi, çift odacıklı tasarımın uzun süreli, periyodik SRS görüntüleme altında hücre büyümesi için en uygun hücre kültürü koşulunu sağladığını doğrulamak için ölçülmüştür (Şekil 3). Daha sonra sistemin SKOV3 kanser hücrelerinde hızlandırılmış görüntüleme ve lipit damlacıklarının (LD’ler) izlenmesi için uygulanmasını gösterdik (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hızlandırılmış canlı hücreli SRS mikroskopisi, molekül takibi için etiketsiz bir şekilde alternatif bir görüntüleme tekniğidir. Floresan etiketleme ile karşılaştırıldığında, SRS görüntüleme fotobeyazlatma içermez ve moleküllerin uzun süreli izlenmesini sağlar. Bununla birlikte, bugüne kadar, dik SRS mikroskobu üzerindeki canlı hücre görüntüleme sistemi ticari olarak mevcut değildir. Bu çalışmada, iletilen SRS hızlandırılmış görüntülemeyi sağlamak için kararlı bir termal …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Binghamton Üniversitesi’ndeki 2019 Lisans Kıdemli Tasarım Ekibine (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza ve James Walsh) mikroskop muhafaza kutusunun tasarımı, üretimi ve testi için teşekkür etmek istiyoruz. Binghamton Üniversitesi’nden Scott Hancock, Olga Petrova ve Fabiola Moreno Olivas’a yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından R15GM140444 Ödül Numarası altında desteklenmiştir.
Materials
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. . Introduction to Optical Microscopy. , (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. . Methods in Cell Biology. (139), 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. . Fluorescent Microscopy. , 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R. Live-cell imaging: the cell’s perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
