Summary

Ein reproduzierbares Knorpelimpaktmodell zur Erzeugung einer posttraumatischen Arthrose beim Kaninchen

Published: November 21, 2023
doi:

Summary

Das offene mediale femorale Kondylus-Impaktmodell bei Kaninchen ist zuverlässig für die Untersuchung der posttraumatischen Osteoarthritis (PTOA) und neuer therapeutischer Strategien zur Eindämmung der PTOA-Progression. Dieses Protokoll erzeugt einen isolierten Knorpeldefekt des hinteren medialen Femurkondylus bei Kaninchen unter Verwendung eines schlittenbasierten Fallturms mit einem Impaktorkopf.

Abstract

Posttraumatische Osteoarthritis (PTOA) ist für 12 % aller Arthrosefälle in den Vereinigten Staaten verantwortlich. Die PTOA kann durch ein einzelnes traumatisches Ereignis ausgelöst werden, z. B. durch eine starke Belastung des Gelenkknorpels, oder durch eine Gelenkinstabilität, wie sie bei einer Ruptur des vorderen Kreuzbandes auftritt. Derzeit gibt es keine wirksamen Therapeutika zur Vorbeugung von PTOA. Die Entwicklung eines zuverlässigen Tiermodells für PTOA ist notwendig, um die Mechanismen, durch die Knorpelschäden ablaufen, besser zu verstehen und neue Behandlungsstrategien zu untersuchen, um das Fortschreiten der PTOA zu lindern oder zu verhindern. Dieses Protokoll beschreibt ein offenes, auf einem Fallturm basierendes Stoßmodell für den Femurkondylus von Kaninchen, um Knorpelschäden zu induzieren. Dieses Modell lieferte Spitzenlasten von 579,1 ± 71,1 N und Spitzenspannungen von 81,9 ± 10,1 MPa bei einer Time-to-Peak-Last von 2,4 ± 0,5 ms. Gelenkknorpel von impaktierten medialen Femurkondylen (MFCs) wiesen höhere Raten an apoptotischen Zellen (p = 0,0058) auf und besaßen höhere Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-Werte von 3,38 ± 1,43 im Vergleich zu den nicht impaktierten kontralateralen MFCs (0,56 ± 0,42) und anderen Knorpeloberflächen des retinierten Knies (p < 0,0001). Es wurden keine Unterschiede in den OARSI-Scores zwischen den nicht impaktierten Gelenkflächen festgestellt (p > 0,05).

Introduction

Posttraumatische Osteoarthritis (PTOA) ist weltweit eine der Hauptursachen für Behinderungen und macht 12 % bis 16 % der symptomatischen Osteoarthritis (OA) aus1. Der derzeitige Goldstandard für die Behandlung von Arthrose im Endstadium ist die totale Knie- und Hüftendoprothetik2 oder die Arthrodese, wie im Fall der tibiotalaren oder subtalaren Arthritis im Endstadium. Obwohl die Endoprothetik weitgehend erfolgreich ist, kann sie kostspielige und krankhafte Komplikationen mit sich bringen3. Darüber hinaus ist eine Endoprothetik bei Patienten unter 50 Jahren weniger wünschenswert, da die Überlebensrate bei revisionsfreien Implantaten bei 77 % bis 83 % gering ist4,5. Derzeit gibt es keine von der FDA zugelassenen Behandlungen, um das Fortschreiten der PTOA zu verhindern oder zu mildern.

PTOA betrifft das gesamte Gelenk, einschließlich des Synovialgewebes, des subchondralen Knochens und des Gelenkknorpels. Sie ist gekennzeichnet durch Gelenkknorpeldegeneration, Synovialentzündung, subchondralen Knochenumbau und Osteophytenbildung 6,7. Der Phänotyp der PTOA entwickelt sich über einen komplexen Prozess des Zusammenspiels von Knorpel, Synovium und subchondralem Knochen. Nach derzeitigem Verständnis führt eine Knorpelverletzung zur Freisetzung von Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) wie Typ-2-Kollagen (COL2) und Aggrecan (ACAN). Diese EZM-Komponentenfragmente sind entzündungsfördernd und verursachen eine erhöhte Produktion von IL-6, IL-1β und reaktiven Sauerstoffspezies. Diese Mediatoren wirken auf Chondrozyten und verursachen eine Hochregulierung von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) wie MMP-13, die den Gelenkknorpel abbauen und gleichzeitig die Matrixsynthese verringern, was zu einem allgemeinen katabolen Milieu für den Gelenkknorpel führt8. Darüber hinaus gibt es Hinweise auf eine erhöhte Chondrozyten-Apoptose bei primärer Arthrose und PTOA 9,10. Eine mitochondriale Dysfunktion tritt nach supraphysiologischer Belastung des Knorpels auf 11,12,13,14, was zu einer erhöhten Apoptose der Chondrozyten führen kann 12,15. Eine verstärkte Chondrozyten-Apoptose wurde mit einer erhöhten Proteoglykan-Depletion und einem Knorpelkatabolismus in Verbindung gebracht und geht nachweislich Veränderungen des Knorpels und des subchondralen Knochenumbaus voraus16,17,18.

Wie bei den meisten menschlichen Krankheiten sind zuverlässige und translationale Modelle der PTOA erforderlich, um die Pathophysiologie der Krankheit besser zu verstehen und neue Therapeutika zu testen. Große Tiere wie Schweine und Hunde wurden in intraartikulären Fraktur- und Impaktmodellen von PTOA17,19 verwendet, aber sie sind kostspielig. Kleinere Tiermodelle wie Mäuse, Ratten und Kaninchen sind kostengünstiger und werden verwendet, um PTOA zu untersuchen, die durch Gelenkdestabilisierung entsteht, was typischerweise eine chirurgische Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und/oder eine Störung des Innenmeniskusbeinhaltet 20,21,22,23,24,25. Obwohl ein Gelenktrauma zu verschiedenen Folgen führen kann, einschließlich Bandverletzungen26, kommt es in fast allen Fällen zu einer mechanischen Überlastung des Knorpels.

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Pathologie hinter der Entwicklung von PTOA nach Bandinstabilität (wie bei einer VKB-Durchtrennung) und einer akuten chondralen Verletzung auf unterschiedliche Mechanismen zurückzuführen ist27. Daher ist es wichtig, Modelle für die direkte Schädigung des Knorpels zu entwickeln. Derzeit gibt es eine begrenzte Anzahl von Impaktmodellen, die osteochondrale oder chondrale Verletzungen bei Ratten und Mäusen hervorrufen28,29. Der murine Knorpel ist jedoch nicht gut geeignet, um isolierte chondrale Defekte zu erzeugen. Dies liegt daran, dass der murine Gelenkknorpel nur 3-5 Zellschichten dick ist und keine organisierten oberflächlichen, radialen und Übergangsknorpelzonen sowie die dicke verkalkte Knorpelschicht aufweist, die bei Menschen und größeren Tieren zu finden ist. Mausmodelle zeigen auch eine spontane Auflösung von partiellen Knorpeldefekten30,31. Daher haben wir uns für das Kaninchen für dieses Aufprallmodell entschieden, da seine Knorpeldicke und -organisation denen des Menschen ähneln und es das kleinste Tiermodell ist, das die Verabreichung eines konsistenten chondralen Aufpralls ermöglicht, der zu PTOA führt. Frühere offene chirurgische Modelle des Aufpralls des Femurkondylus beim Kaninchen verwendeten ein Pendel32, eine handgehaltene, federbelastete Knorpelimpaktionsvorrichtung33 und einen Fallturm, der die Erzeugung eines kaninchenspezifischen Impaktors34 ermöglichte. Diesen Studien fehlten jedoch In-vivo-Daten. Andere haben In-vivo-Daten mit pendelbasierten35, pneumatischen36 und federbelasteten37 Schlaggeräten10 berichtet, und diese Studien zeigen eine hohe Variabilität der Spitzenbelastung und der Belastungsraten zwischen den Methoden. Dennoch fehlt es an einem konsistenten Ansatz, um akute Knorpeltraumata in vivo zuverlässig zu modellieren.

Das derzeitige Protokoll verwendet ein Fallturm-basiertes System, um einen gleichmäßigen Aufprall auf den hinteren medialen Kondylus des Kaninchenknies zu erzielen. Ein posteriorer Zugang zum Knie wird verwendet, um den hinteren medialen Femurkondylus freizulegen. Ein Steinman-Stift wird dann quer über die Femurkondylen von medial nach lateral in einer Linie mit der Gelenkoberfläche platziert und an der Plattform befestigt. Nach der Sicherung wird eine Ladung an den hinteren medialen Femurkondylus abgegeben. Diese Methode ermöglicht es, eine gleichmäßige Knorpelschädigung auf die gewichtstragende Oberfläche des distalen Femurs des Kaninchens zu übertragen.

Protocol

Das folgende Verfahren wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Indiana University School of Medicine durchgeführt. Alle Überlebensoperationen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wie in den NIH-Richtlinien beschrieben. Schmerz- und Infektionsrisiken wurden mit geeigneten Analgetika und Antibiotika behandelt, um die erfolgreichen Ergebnisse zu optimieren. Für die vorliegende Studie wurden skelettreife männliche neuseeländische Weißkaninchen mit einem Gewicht von …

Representative Results

Der Erfolg dieses Eingriffs wurde unmittelbar nach dem Aufprall durch die Visualisierung des Kondylus durch den Chirurgen (Abbildung 4A) und durch Röntgenaufnahmen überwacht, um sicherzustellen, dass keine Fraktur auftrat (Abbildung 4B). Es besteht die Gefahr eines Stoßversagens, das zu einer intraoperativen Fraktur des Kondylus führt. Dies war in der Regel auf eine unsachgemäße Platzierung der Steinman-Stifte zurückzuführen (Abbildu…

Discussion

Dieses chirurgische Verfahren zielt darauf ab, in einem Modell der PTOA eine konsistente Knorpelschädigung an der gewichtstragenden Oberfläche des medialen Femurkondylus des Kaninchens zu erzeugen. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass der posteriore Zugang zum Knie eine direkte Visualisierung des kompletten posterioren medialen Femurkondylus ermöglicht und in ca. 37 min durchgeführt werden kann (Tabelle 2). Es sollte auch beachtet werden, dass es sich um ein offenes Verletzungsmodell han…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch das DoD Peer Reviewed Medical Research Program – Investigator-Initiated Research Award W81XWH-20-1-0304 von der U.S. ARMY MEDICAL RESEARCH ACQUISITION ACTIVITY, durch NIH NIAMS R01AR076477 und ein umfassendes Musculoskeletal T32 Training Program der NIH (AR065971) und durch NIH NIAMS Grant R01 AR069657. Die Autoren danken Kevin Carr für die Bereitstellung seines Fachwissens in der Bearbeitung und Herstellung für dieses Projekt sowie Drew Brown und dem Indiana Center for Musculoskeletal Health Bone Histology Core für die Unterstützung bei der Histologie.

Materials

Flat head screw McMaster-Carr 92210A194 Stainless steel hex drive flat head screw, 8-32, 1/2"
#15 scalpel blades McKesson 1029066 Scalpel McKesson No. 15 Stainless Steel / Plastic Classic Grip Handle Sterile Disposable
1/2”-20 threaded rod McMaster-Carr 99065A120 1/2”-20 threaded rod
10 mL syringe McKesson 1031801 For irrigation; General Purpose Syringe McKesson 10 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety
3 mL syringe McKesson 1031804 For lidocaine/bupiviacaine injection; General Purpose Syringe McKesson 3 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety.
3-0 polysorb Ethicon J332H 3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 circle, 26 mm, tapered
4-0 monosorb Ethicon Z397H 4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 circle, 19mm, cutting edge
5-0 polysorb Med Vet International NC9335902 Med Vet International 5-0 ETHICON COATED VICRYL C-3
Accelerometer Kistler 8743A5 Accelerometer
Adson-Browns Forceps World precision tools 500177 Adson-Brown Forceps, 12 cm, Straight, TC Jaws, 7 x 7 Teeth
Alfaxalone Jurox 49480-002-01 Alfaxan Multidose by Jurox : 10 mg/mL
Buprenorphine Par Pharmaceuticals 42023-0179-05 Buprenorphine HCL injection: 0.3 mg/mL
Butorphanol  Zoetis 54771-2033 Butorphanol tartrate 10mg/ml by Zoetis
Chlorhexidine Hand Scrub BD 371073 BD E-Z Scrub 107 Surgical Scrub Brush/Sponge, 4% CHG, Red
Collet STRYKER 14023 Stryker 4100-62 wire Collet 0.28-0.71''
Cordless Driver handpiece STRYKER OR-S4300 Stryker 4300 CD3 Cordless Driver 3 handpiece
Cricket Retractors Novosurgical G3510 21 2x Heiss (Holzheimer) Cross Action Retractor
Dissector Scissors Jorvet labs J0662 Aesculap AG, Metzenbaum, Scissors, Straight 5 3/4″
Elizabethian Collar ElizaSoft 62054 ElizaSoft Elizabethan Recovery Collar
Enrofloxacin Custom Meds Enrofloxacin compounded by Custom Meds
Eye Ointment Pivetal  46066-753-55 Pivetal Articifical Tears- recently recalled
Face-mount shaft collar McMaster-Carr 5631T11 Face-mount shaft collar
Fast green Millipore Sigma F7258 Fast green
Freer Jorvet labs J0226Q Freer elevator
Head screw -1 McMaster-Carr 91251A197 Black-oxide alloy steel socket head screw, 8-32, 3/4"
Head screw -2 McMaster-Carr 92196A194 Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2"
Head screw -3 McMaster-Carr 92196A146 Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2"
Head screw -4 McMaster-Carr 92196A151 Stainless steel socket head screw, 6-32, 3/4"
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 Millipore Sigma GHS132-1L Hematoxylin Solution, Gill No. 1
Hex nut McMaster-Carr 91841A007 Stainless steel hex nut, 6-32
Hold-down toggle clamp McMaster-Carr 5126A71 Hold-down toggle clamp
Impact device n/a n/a custom made
Impact platform n/a n/a custom made
K-wires Jorvet Labs J0250A JorVet Intramedullary Steinman Pins, Trocar-Trocar 1/16" x 7"
Lab View National Instruments n/a n/a
Load cell Kistler 9712B5000 Load cell
MATLAB The MathWorks Inc. n/a n/a
Microscope Leica DMi-8 Leica DMi8 microscope with LAS-X software
Midazolam Almaject 72611-749-10 Midazolam Hydrochloride injection: 5mg/ml by Almaject
milling machine depth stops McMaster-Carr 2949A71 Clamp-on milling machine depth stops
Mobile C-arm Philips 718095 BV Pulsera, Mobile C-arm
Mounted linear ball bearing McMaster-Carr 9338T7 Mounted linear ball bearing
Needle Driver A2Z Scilab A2ZTCIN39 TC Webster Needle Holder Smooth Jaws 5", Premium
Pentobarbital Vortech 0298-9373-68 Pentobarbital 390 mg/mL by Vortech
Safranin O Millipore Sigma HT90432 Safranin O
Small Battery pack STRYKER NS014036 6212 Small Battery pack- 9.6 V
Steel rod, 2’ McMaster-Carr 89535K25 Steel rod, 2’
Sterile Saline ICU Medical 6139-22 AquaLite Solution Pour Bottles, 250 mL
Stryker 6110-120 System 6 Battery Charger STRYKER OR-S6110-120
Surgical gloves McKesson 1044729 Surgical Glove McKesson Perry Size 6.5 Sterile Pair Latex Extended Cuff Length Smooth Brown Not Chemo Approved
Surgical gown McKesson 1104452 Non-Reinforced Surgical Gown with Towel McKesson Large Blue Sterile AAMI Level 3 Disposable
Suture scissors Jorvet Labs J0910SA Super Cut Scissors, Mayo, Straight, 5 1/2″
TUNEL staining kit ABP Bioscience A049 TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection Kit
Weitlaner Retractors Fine Science Tools 17012-11 2x Weitlaner-Locktite Retractors

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Citer Cet Article
Dilley, J., Noori-Dokht, H., Seetharam, A., Bello, M., Nanavaty, A., Natoli, R. M., McKinley, T., Bault, Z., Wagner, D., Sankar, U. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J. Vis. Exp. (201), e64450, doi:10.3791/64450 (2023).

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