Modelo de impacto de cartilagem reprodutível para gerar osteoartrite pós-traumática em coelhos

Summary

O modelo aberto de impacto do côndilo femoral medial em coelhos é confiável para estudar a osteoartrite pós-traumática (PTOA) e novas estratégias terapêuticas para mitigar a progressão da PTOA. Este protocolo gera um defeito cartilaginoso isolado do côndilo femoral medial posterior em coelhos utilizando uma torre de queda baseada em carruagem com cabeça de impacto.

Abstract

A osteoartrite pós-traumática (PTOA) é responsável por 12% de todos os casos de osteoartrite nos Estados Unidos. A PTOA pode ser iniciada por um único evento traumático, como uma carga de alto impacto atuando na cartilagem articular, ou por instabilidade articular, como ocorre com a ruptura do ligamento cruzado anterior. Atualmente, não existem terapêuticas eficazes para prevenir a PTOA. O desenvolvimento de um modelo animal confiável de PTOA é necessário para entender melhor os mecanismos pelos quais o dano cartilaginoso procede e investigar novas estratégias de tratamento para aliviar ou prevenir a progressão da PTOA. Este protocolo descreve um modelo de impacto do côndilo femoral de coelho aberto, baseado em torre de queda, para induzir dano cartilaginoso. Este modelo forneceu cargas de pico de 579,1 ± 71,1 N, e tensões de pico de 81,9 ± 10,1 MPa com uma carga de tempo para pico de 2,4 ± 0,5 ms. A cartilagem articular dos côndilos femorais mediais impactados (CFMs) apresentou maiores taxas de células apoptóticas (p = 0,0058) e possuía escores mais altos na Osteoarthritis Research Society International (OARSI) de 3,38 ± 1,43 em comparação com as CFMs contralaterais não impactadas (0,56 ± 0,42) e outras superfícies cartilaginosas do joelho impactado (p < 0,0001). Não foram detectadas diferenças nos escores do OARSI entre as superfícies articulares não impactadas (p > 0,05).

Introduction

A osteoartrite pós-traumática (OTP) é uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo, sendo responsável por 12%-16% da osteoartrite (OA) ^{sintomática1}. O padrão-ouro atual para o tratamento da OA terminal é a artroplastia total de joelho e quadril² ou artrodese, como no caso da artrite tíbio-talar ou subtalar em estágio terminal. Apesar de amplamente bem sucedida, a artroplastia pode apresentar complicações dispendiosas e mórbidas3. Além disso, a artroplastia é menos desejável em pacientes com menos de 50 anos, dada a baixa sobrevida livre de revisões do implante de 77%-83%^4,5. Atualmente, não existem tratamentos aprovados pela FDA para prevenir ou mitigar a progressão da PTOA.

A PTOA afeta toda a articulação, incluindo o tecido sinovial, o osso subcondral e a cartilagem articular. Caracteriza-se por degeneração da cartilagem articular, inflamação sinovial, remodelação óssea subcondral e formação de osteófitos6,7. O fenótipo da PTOA se desenvolve através de um complexo processo de interação entre cartilagem, sinóvia e osso subcondral. O entendimento atual é que a lesão da cartilagem leva à liberação de componentes da matriz extracelular (MEC), como colágeno tipo 2 (COL2) e agrecan (ACAN). Esses fragmentos componentes da MEC são pró-inflamatórios e causam aumento da produção de IL-6, IL-1β e espécies reativas de oxigênio. Esses mediadores atuam nos condrócitos, causando upregulation das metaloproteinases da matriz (MMPs), como as MMP-13, que degradam a cartilagem articular ao mesmo tempo em que diminuem a síntese da matriz, levando a um ambiente catabólico global para a cartilagem^articular8. Além disso, há evidências de aumento da apoptose de condrócitos na osteoartrite primária e na PTOA ^9,10. A disfunção mitocondrial ocorre após carga suprafisiológica da cartilagem 11,12,13,14, o que pode levar ao aumento da apoptose dos condrócitos ^12,15. O aumento da apoptose dos condrócitos tem sido associado ao aumento da depleção de proteoglicanos e do catabolismo cartilaginoso e tem demonstrado preceder alterações na remodelação da cartilagem e do osso subcondral^16,17,18.

Como acontece com a maioria das doenças humanas, modelos confiáveis e translacionais de PTOA são necessários para entender melhor a fisiopatologia da doença e testar novas terapêuticas. Animais de grande porte, como suínos e caninos, têm sido utilizados em modelos de fratura intra-articular e impacto de PTOA^17,19, mas são dispendiosos. Modelos animais menores, como camundongos, ratos e coelhos, são menos dispendiosos e utilizados para estudar a PTOA gerada pela desestabilização articular, que tipicamente envolve transecção cirúrgica do ligamento cruzado anterior (LCA) e/ou ruptura do menisco medial20,21,22,23,24,25. Embora o trauma articular possa levar a várias consequências, incluindo lesão ligamentar²⁶, a sobrecarga mecânica da cartilagem ocorre em quase todos os casos.

Há evidências emergentes de que a patologia por trás do desenvolvimento da PTOA após instabilidade ligamentar (como na transecção do LCA) e lesão condral aguda é devida a mecanismos distintos²⁷. Portanto, o desenvolvimento de modelos de lesão direta da cartilagem é importante. Atualmente, há um número limitado de modelos de impacto que geram lesão osteocondral ou condral em ratos e^{camundongos28,29}. No entanto, a cartilagem murina não é adequada para gerar defeitos condrais isolados. Isso ocorre porque a cartilagem articular murina tem apenas 3-5 camadas de células de espessura e não possui zonas organizadas de cartilagem superficial, radial e de transição, bem como a espessa camada de cartilagem calcificada encontrada em humanos e animais maiores. Modelos murinos também apresentam resolução espontânea de defeitos parciais da cartilagem^30,31. Assim, escolhemos o coelho para este modelo de impacto, pois sua espessura e organização da cartilagem são semelhantes às dos seres humanos, e é o menor modelo animal que permitirá a entrega de um impacto condral consistente que resulta em PTOA. Modelos cirúrgicos abertos prévios de impacto do côndilo femoral em coelhos empregaram um pêndulo³², um dispositivo portátil de impactação de cartilagem carregado com mola 33 e uma torre de queda que permitiu a criação de impactores específicos para coelhos³⁴. No entanto, esses estudos careciam de dados in vivo. Outros relataram dados in vivo com dispositivos de impacto baseados em pêndulo³⁵, pneumáticos³⁶ e³⁷ carregados com mola¹⁰, e esses estudos mostram uma alta taxa de variabilidade nas taxas de pico de tensão e carregamento entre os métodos. Ainda assim, o campo carece de uma abordagem consistente para modelar de forma confiável o trauma agudo da cartilagem in vivo.

O protocolo atual emprega um sistema baseado em torre de queda para fornecer um impacto consistente no côndilo medial posterior do joelho do coelho. Uma abordagem posterior do joelho é empregada para expor o côndilo femoral medial posterior. Um pino de Steinman é então colocado através dos côndilos femorais de medial para lateral em linha com a superfície articular e fixado à plataforma. Uma vez fixada, uma carga é entregue ao côndilo femoral medial posterior. Este método permite que danos consistentes na cartilagem sejam administrados à superfície de sustentação de peso do fêmur distal do coelho.

Protocol

O procedimento a seguir foi realizado com aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana. Todas as cirurgias de sobrevida foram realizadas em condições estéreis, conforme descrito pelas diretrizes do NIH. Os riscos de dor e infecção foram manejados com analgésicos e antibióticos adequados para otimizar os resultados bem-sucedidos. Coelhos machos da raça Nova Zelândia Brancos, esqueleticamente maduros, pesando entre 3,0 e 4,0 kg, foram…

Representative Results

O sucesso desse procedimento foi monitorado imediatamente após o impacto pela visualização do côndilo pelo cirurgião (Figura 4A) e por radiografias para garantir que não ocorresse fratura (Figura 4B). Existe o risco de falha do impacto levando a uma fratura intraoperatória do côndilo. Isso ocorreu tipicamente devido à colocação inadequada do pino de Steinman (Figura 5). Utilizando esse modelo, houve uma taxa de falha da f…

Discussion

Este procedimento cirúrgico visa gerar danos consistentes da cartilagem à superfície de sustentação de peso do côndilo femoral medial de coelhos em um modelo de PTOA. Uma vantagem desse procedimento é que a abordagem posterior do joelho permite a visualização direta do côndilo femoral medial posterior completo, podendo ser realizada em aproximadamente 37 min (Tabela 2). Deve-se ressaltar também que este é um modelo de lesão aberta e pode levar a alterações inflamatórias agudas além do im…

Materials

Flat head screw	McMaster-Carr	92210A194	Stainless steel hex drive flat head screw, 8-32, 1/2"
#15 scalpel blades	McKesson	1029066	Scalpel McKesson No. 15 Stainless Steel / Plastic Classic Grip Handle Sterile Disposable
1/2”-20 threaded rod	McMaster-Carr	99065A120	1/2”-20 threaded rod
10 mL syringe	McKesson	1031801	For irrigation; General Purpose Syringe McKesson 10 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety
3 mL syringe	McKesson	1031804	For lidocaine/bupiviacaine injection; General Purpose Syringe McKesson 3 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety.
3-0 polysorb	Ethicon	J332H	3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 circle, 26 mm, tapered
4-0 monosorb	Ethicon	Z397H	4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 circle, 19mm, cutting edge
5-0 polysorb	Med Vet International	NC9335902	Med Vet International 5-0 ETHICON COATED VICRYL C-3
Accelerometer	Kistler	8743A5	Accelerometer
Adson-Browns Forceps	World precision tools	500177	Adson-Brown Forceps, 12 cm, Straight, TC Jaws, 7 x 7 Teeth
Alfaxalone	Jurox	49480-002-01	Alfaxan Multidose by Jurox : 10 mg/mL
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals	42023-0179-05	Buprenorphine HCL injection: 0.3 mg/mL
Butorphanol	Zoetis	54771-2033	Butorphanol tartrate 10mg/ml by Zoetis
Chlorhexidine Hand Scrub	BD	371073	BD E-Z Scrub 107 Surgical Scrub Brush/Sponge, 4% CHG, Red
Collet	STRYKER	14023	Stryker 4100-62 wire Collet 0.28-0.71''
Cordless Driver handpiece	STRYKER	OR-S4300	Stryker 4300 CD3 Cordless Driver 3 handpiece
Cricket Retractors	Novosurgical	G3510 21	2x Heiss (Holzheimer) Cross Action Retractor
Dissector Scissors	Jorvet labs	J0662	Aesculap AG, Metzenbaum, Scissors, Straight 5 3/4″
Elizabethian Collar	ElizaSoft	62054	ElizaSoft Elizabethan Recovery Collar
Enrofloxacin	Custom Meds		Enrofloxacin compounded by Custom Meds
Eye Ointment	Pivetal	46066-753-55	Pivetal Articifical Tears- recently recalled
Face-mount shaft collar	McMaster-Carr	5631T11	Face-mount shaft collar
Fast green	Millipore Sigma	F7258	Fast green
Freer	Jorvet labs	J0226Q	Freer elevator
Head screw -1	McMaster-Carr	91251A197	Black-oxide alloy steel socket head screw, 8-32, 3/4"
Head screw -2	McMaster-Carr	92196A194	Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2"
Head screw -3	McMaster-Carr	92196A146	Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2"
Head screw -4	McMaster-Carr	92196A151	Stainless steel socket head screw, 6-32, 3/4"
Hematoxylin Solution, Gill No. 1	Millipore Sigma	GHS132-1L	Hematoxylin Solution, Gill No. 1
Hex nut	McMaster-Carr	91841A007	Stainless steel hex nut, 6-32
Hold-down toggle clamp	McMaster-Carr	5126A71	Hold-down toggle clamp
Impact device	n/a	n/a	custom made
Impact platform	n/a	n/a	custom made
K-wires	Jorvet Labs	J0250A	JorVet Intramedullary Steinman Pins, Trocar-Trocar 1/16" x 7"
Lab View	National Instruments	n/a	n/a
Load cell	Kistler	9712B5000	Load cell
MATLAB	The MathWorks Inc.	n/a	n/a
Microscope	Leica	DMi-8	Leica DMi8 microscope with LAS-X software
Midazolam	Almaject	72611-749-10	Midazolam Hydrochloride injection: 5mg/ml by Almaject
milling machine depth stops	McMaster-Carr	2949A71	Clamp-on milling machine depth stops
Mobile C-arm	Philips	718095	BV Pulsera, Mobile C-arm
Mounted linear ball bearing	McMaster-Carr	9338T7	Mounted linear ball bearing
Needle Driver	A2Z Scilab	A2ZTCIN39	TC Webster Needle Holder Smooth Jaws 5", Premium
Pentobarbital	Vortech	0298-9373-68	Pentobarbital 390 mg/mL by Vortech
Safranin O	Millipore Sigma	HT90432	Safranin O
Small Battery pack	STRYKER	NS014036	6212 Small Battery pack- 9.6 V
Steel rod, 2’	McMaster-Carr	89535K25	Steel rod, 2’
Sterile Saline	ICU Medical	6139-22	AquaLite Solution Pour Bottles, 250 mL
Stryker 6110-120 System 6 Battery Charger	STRYKER	OR-S6110-120
Surgical gloves	McKesson	1044729	Surgical Glove McKesson Perry Size 6.5 Sterile Pair Latex Extended Cuff Length Smooth Brown Not Chemo Approved
Surgical gown	McKesson	1104452	Non-Reinforced Surgical Gown with Towel McKesson Large Blue Sterile AAMI Level 3 Disposable
Suture scissors	Jorvet Labs	J0910SA	Super Cut Scissors, Mayo, Straight, 5 1/2″
TUNEL staining kit	ABP Bioscience	A049	TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection Kit
Weitlaner Retractors	Fine Science Tools	17012-11	2x Weitlaner-Locktite Retractors