Модель воздействия открытого медиального мыщелка бедренной кости у кроликов надежна для изучения посттравматического остеоартрита (ПТОА) и новых терапевтических стратегий для смягчения прогрессирования ПТС. Этот протокол генерирует изолированный дефект хряща заднего медиального мыщелка бедренной кости у кроликов с использованием подвесной башни на базе каретки с ударной головкой.
Посттравматический остеоартрит (PTOA) является причиной 12% всех случаев остеоартрита в Соединенных Штатах. ПТА может быть инициирована единичным травматическим событием, таким как сильная ударная нагрузка, действующая на суставной хрящ, или нестабильностью сустава, как это происходит при разрыве передней крестообразной связки. В настоящее время не существует эффективных терапевтических средств для профилактики ПТОС. Разработка надежной модели ПТА на животных необходима для лучшего понимания механизмов, с помощью которых происходит повреждение хряща, и для изучения новых стратегий лечения для облегчения или предотвращения прогрессирования ПТОА. В этом протоколе описывается модель воздействия мыщелка бедренной кости кролика с открытой башней для индуцирования повреждения хряща. Эта модель обеспечивала пиковые нагрузки 579,1 ± 71,1 Н и пиковые напряжения 81,9 ± 10,1 МПа при нагрузке 2,4 ± 0,5 мс. Суставной хрящ из ретинированных медиальных мыщелков бедренной кости (MFC) имел более высокую частоту апоптотических клеток (p = 0,0058) и обладал более высокими баллами по шкале Международного общества исследования остеоартрита (OARSI) 3,38 ± 1,43 по сравнению с неретинированными контралатеральными MFC (0,56 ± 0,42), а другие хрящевые поверхности пораженного коленного сустава (p < 0,0001). Различий в показателях OARSI не выявлено среди суставных поверхностей без ретинации (p > 0,05).
Посттравматический остеоартрит (ПТОА) является ведущей причиной инвалидности во всем мире и составляет 12–16% случаев симптоматического остеоартрита (ОА)1. В настоящее время золотым стандартом лечения терминальной стадии ОА является тотальное эндопротезирование коленного и тазобедренного суставов2 или артродез, как и в случае терминальной стадии большеберцового или подтаранного артрита. Несмотря на то, что эндопротезирование в значительной степени успешно, оно может иметь дорогостоящие и болезненные осложнения3. Кроме того, эндопротезирование менее желательно у пациентов моложе 50 лет, учитывая низкую выживаемость имплантатов без ревизии – 77%-83%4,5. В настоящее время не существует одобренных FDA методов лечения для предотвращения или смягчения прогрессирования PTOA.
ПТОА поражает весь сустав, включая синовиальную ткань, субхондральную кость и суставной хрящ. Характеризуется дегенерацией суставного хряща, воспалением синовиальной оболочки, субхондральным ремоделированием кости и образованием остеофитов 6,7. Фенотип ПТА развивается в результате сложного процесса взаимодействия между хрящом, синовиальной оболочкой и субхондральной костью. В настоящее время считается, что повреждение хряща приводит к высвобождению компонентов внеклеточного матрикса (ECM), таких как коллаген 2-го типа (COL2) и аггрекан (ACAN). Эти фрагменты компонентов ECM являются провоспалительными и вызывают повышенную продукцию IL-6, IL-1β и активных форм кислорода. Эти медиаторы действуют на хондроциты, вызывая повышенную регуляцию матриксных металлопротеиназ (ММП), таких как MMP-13, которые разрушают суставной хрящ, а также снижают синтез матрикса, что приводит к созданию общей катаболической среды для суставного хряща8. Кроме того, имеются данные о повышенном апоптозе хондроцитов при первичном остеоартрозе и PTOA 9,10. Митохондриальная дисфункция возникает после супрафизиологической нагрузки хряща 11,12,13,14, что может привести к повышению апоптоза хондроцитов12,15. Усиленный апоптоз хондроцитов был связан с повышенным истощением протеогликанов и катаболизмом хряща и, как было показано, предшествует изменениям в ремоделировании хряща и субхондральной кости16,17,18.
Как и в случае с большинством заболеваний человека, для дальнейшего понимания патофизиологии заболевания и тестирования новых методов лечения необходимы надежные и трансляционные модели ПТОЗ. Крупные животные, такие как свиньи и собаки, использовались в моделях внутрисуставных переломов и ударов PTOA17,19, но они дорогостоящие. Более мелкие животные модели, такие как мыши, крысы и кролики, дешевле и используются для изучения ПТС, возникающей в результате дестабилизации сустава, которая обычно включает хирургическое рассечение передней крестообразной связки (ПКС) и/или разрушение медиального мениска 20,21,22,23,24,25. Хотя травма сустава может привести к различным последствиям, включая повреждение связок26, механическая перегрузка хряща происходит почти во всех случаях.
Появляются новые доказательства того, что патология, лежащая в основе развития ПТОА после нестабильности связок (как при рассечении передней крестообразной связки) и острого хондрального повреждения, обусловлена различными механизмами27. Поэтому важна разработка моделей прямого повреждения хряща. В настоящее время существует ограниченное число моделей удара, вызывающих остеохондральное или хондральное повреждение у крыс и мышей28,29. Однако мышиный хрящ не очень хорошо подходит для образования изолированных хондральных дефектов. Это связано с тем, что суставной хрящ мышей имеет толщину всего 3-5 клеточных слоев и не имеет организованных поверхностных, радиальных и переходных хрящевых зон, а также толстого кальцинированного хрящевого слоя, обнаруженного у людей и более крупных животных. Мышиные модели также демонстрируют спонтанное разрешение частичных дефектов хряща30,31. Таким образом, мы выбрали кролика для этой модели удара, поскольку толщина и организация его хряща аналогичны человеческим, и это самая маленькая модель животного, которая позволит нанести постоянный хондральный удар, который приводит к PTOA. В предыдущих открытых хирургических моделях удара мыщелка бедренной кости у кролика использовались маятник32, ручное подпружиненное устройство 33 для захвата хряща и падающая башня, которая позволяла создавать специфичный для кролика ударный механизм34. Однако в этих исследованиях отсутствовали данные in vivo. Другие исследователи сообщали данные in vivo с маятниковыми35, пневматическими 36 и подпружиненными37 ударными устройствами10, и эти исследования показывают высокую вариабельность пикового напряжения и скорости нагрузки между методами. Тем не менее, в этой области отсутствует последовательный подход к надежному моделированию острой травмы хряща in vivo.
В текущем протоколе используется система на основе падающей башни для обеспечения последовательного воздействия на задний медиальный мыщелок колена кролика. Задний доступ к коленному суставу используется для обнажения заднего медиального мыщелка бедренной кости. Затем штифт Штейнмана помещается поперек мыщелков бедренной кости от медиального до латерального на одной линии с суставной поверхностью и закрепляется на платформе. После закрепления нагрузка доставляется в задний медиальный мыщелок бедренной кости. Этот метод позволяет добиться последовательного повреждения хряща на несущей поверхности дистального отдела бедренной кости кролика.
Эта хирургическая процедура направлена на создание последовательного повреждения хряща несущей поверхности медиального мыщелка бедренной кости кролика в модели PTOA. Преимущество этой процедуры заключается в том, что задний доступ к коленному суставу позволяет непосредственно визуа?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Программой рецензируемых медицинских исследований Министерства обороны США – Исследовательская премия, инициированная исследователями, W81XWH-20-1-0304 от U.S. ARMY MEDICAL RESEARCH ACQUISITION ACTIVITY, NIH NIAMS R01AR076477 и Комплексной программой обучения опорно-двигательного аппарата T32 от NIH (AR065971) и грантом NIH NIAMS R01 AR069657. Авторы хотели бы поблагодарить Кевина Карра (Kevin Carr) за предоставление своего опыта в области механической обработки и изготовления для этого проекта, а также Дрю Брауна (Drew Brown) и Центр гистологии костей опорно-двигательного аппарата штата Индиана (Indiana Center for Musculoskeletal Health Bone Histology Core) за помощь в гистологии.
Flat head screw | McMaster-Carr | 92210A194 | Stainless steel hex drive flat head screw, 8-32, 1/2" |
#15 scalpel blades | McKesson | 1029066 | Scalpel McKesson No. 15 Stainless Steel / Plastic Classic Grip Handle Sterile Disposable |
1/2”-20 threaded rod | McMaster-Carr | 99065A120 | 1/2”-20 threaded rod |
10 mL syringe | McKesson | 1031801 | For irrigation; General Purpose Syringe McKesson 10 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety |
3 mL syringe | McKesson | 1031804 | For lidocaine/bupiviacaine injection; General Purpose Syringe McKesson 3 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety. |
3-0 polysorb | Ethicon | J332H | 3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 circle, 26 mm, tapered |
4-0 monosorb | Ethicon | Z397H | 4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 circle, 19mm, cutting edge |
5-0 polysorb | Med Vet International | NC9335902 | Med Vet International 5-0 ETHICON COATED VICRYL C-3 |
Accelerometer | Kistler | 8743A5 | Accelerometer |
Adson-Browns Forceps | World precision tools | 500177 | Adson-Brown Forceps, 12 cm, Straight, TC Jaws, 7 x 7 Teeth |
Alfaxalone | Jurox | 49480-002-01 | Alfaxan Multidose by Jurox : 10 mg/mL |
Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | 42023-0179-05 | Buprenorphine HCL injection: 0.3 mg/mL |
Butorphanol | Zoetis | 54771-2033 | Butorphanol tartrate 10mg/ml by Zoetis |
Chlorhexidine Hand Scrub | BD | 371073 | BD E-Z Scrub 107 Surgical Scrub Brush/Sponge, 4% CHG, Red |
Collet | STRYKER | 14023 | Stryker 4100-62 wire Collet 0.28-0.71'' |
Cordless Driver handpiece | STRYKER | OR-S4300 | Stryker 4300 CD3 Cordless Driver 3 handpiece |
Cricket Retractors | Novosurgical | G3510 21 | 2x Heiss (Holzheimer) Cross Action Retractor |
Dissector Scissors | Jorvet labs | J0662 | Aesculap AG, Metzenbaum, Scissors, Straight 5 3/4″ |
Elizabethian Collar | ElizaSoft | 62054 | ElizaSoft Elizabethan Recovery Collar |
Enrofloxacin | Custom Meds | Enrofloxacin compounded by Custom Meds | |
Eye Ointment | Pivetal | 46066-753-55 | Pivetal Articifical Tears- recently recalled |
Face-mount shaft collar | McMaster-Carr | 5631T11 | Face-mount shaft collar |
Fast green | Millipore Sigma | F7258 | Fast green |
Freer | Jorvet labs | J0226Q | Freer elevator |
Head screw -1 | McMaster-Carr | 91251A197 | Black-oxide alloy steel socket head screw, 8-32, 3/4" |
Head screw -2 | McMaster-Carr | 92196A194 | Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2" |
Head screw -3 | McMaster-Carr | 92196A146 | Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2" |
Head screw -4 | McMaster-Carr | 92196A151 | Stainless steel socket head screw, 6-32, 3/4" |
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | Millipore Sigma | GHS132-1L | Hematoxylin Solution, Gill No. 1 |
Hex nut | McMaster-Carr | 91841A007 | Stainless steel hex nut, 6-32 |
Hold-down toggle clamp | McMaster-Carr | 5126A71 | Hold-down toggle clamp |
Impact device | n/a | n/a | custom made |
Impact platform | n/a | n/a | custom made |
K-wires | Jorvet Labs | J0250A | JorVet Intramedullary Steinman Pins, Trocar-Trocar 1/16" x 7" |
Lab View | National Instruments | n/a | n/a |
Load cell | Kistler | 9712B5000 | Load cell |
MATLAB | The MathWorks Inc. | n/a | n/a |
Microscope | Leica | DMi-8 | Leica DMi8 microscope with LAS-X software |
Midazolam | Almaject | 72611-749-10 | Midazolam Hydrochloride injection: 5mg/ml by Almaject |
milling machine depth stops | McMaster-Carr | 2949A71 | Clamp-on milling machine depth stops |
Mobile C-arm | Philips | 718095 | BV Pulsera, Mobile C-arm |
Mounted linear ball bearing | McMaster-Carr | 9338T7 | Mounted linear ball bearing |
Needle Driver | A2Z Scilab | A2ZTCIN39 | TC Webster Needle Holder Smooth Jaws 5", Premium |
Pentobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | Pentobarbital 390 mg/mL by Vortech |
Safranin O | Millipore Sigma | HT90432 | Safranin O |
Small Battery pack | STRYKER | NS014036 | 6212 Small Battery pack- 9.6 V |
Steel rod, 2’ | McMaster-Carr | 89535K25 | Steel rod, 2’ |
Sterile Saline | ICU Medical | 6139-22 | AquaLite Solution Pour Bottles, 250 mL |
Stryker 6110-120 System 6 Battery Charger | STRYKER | OR-S6110-120 | |
Surgical gloves | McKesson | 1044729 | Surgical Glove McKesson Perry Size 6.5 Sterile Pair Latex Extended Cuff Length Smooth Brown Not Chemo Approved |
Surgical gown | McKesson | 1104452 | Non-Reinforced Surgical Gown with Towel McKesson Large Blue Sterile AAMI Level 3 Disposable |
Suture scissors | Jorvet Labs | J0910SA | Super Cut Scissors, Mayo, Straight, 5 1/2″ |
TUNEL staining kit | ABP Bioscience | A049 | TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection Kit |
Weitlaner Retractors | Fine Science Tools | 17012-11 | 2x Weitlaner-Locktite Retractors |