Количественная оценка циркулярных РНК с использованием цифровой капельной ПЦР
Summary
Этот протокол описывает подробный метод цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки уровней круговой РНК (циркРНК) в клетках с использованием расходящихся праймеров.
Abstract
Цифровая капельно-полимеразная цепная реакция (dd-PCR) является одним из наиболее чувствительных методов количественной оценки; он фракционирует реакцию почти на 20 000 капель воды в масле, и ПЦР происходит в отдельных каплях. dd-PCR имеет несколько преимуществ по сравнению с обычной qPCR в реальном времени, включая повышенную точность в обнаружении мишеней с низкой плотностью, пропуск эталонных генов для количественной оценки, устранение технических реплик для образцов и демонстрацию высокой устойчивости к ингибиторам в образцах. В последнее время дд-ПЦР стала одним из самых популярных методов точной количественной оценки целевой ДНК или РНК для анализа экспрессии генов и диагностики. Круговые РНК (циркРНК) представляют собой большое семейство недавно обнаруженных ковалентно закрытых молекул РНК, не имеющих 5′ и 3′ концов. Было показано, что они регулируют экспрессию генов, действуя как губки для РНК-связывающих белков и микроРНК. Кроме того, циркРНК секретируются в жидкости организма, и их устойчивость к экзонуклеазам делает их биомаркерами для диагностики заболеваний. Эта статья направлена на то, чтобы показать, как выполнить дизайн дивергентного праймера, экстракцию РНК, синтез кДНК и анализ dd-PCR для точной количественной оценки конкретных уровней циркулярной РНК (циркРНК) в клетках. В заключение мы демонстрируем точную количественную оценку циркРНК с помощью dd-PCR.
Introduction
Последние достижения в технологиях секвенирования РНК и новых вычислительных алгоритмах обнаружили нового члена растущего семейства некодирующих РНК, называемого круговой РНК (циркРНК)1. Как следует из названия, циркРНК представляют собой семейство одноцепочечных молекул РНК без свободных концов. Они образованы неканоническим сращиванием голова к хвосту, называемым обратным сращиванием, где восходящий акцептор сращивания соединяется ковалентно с нисходящим донорским сайтом сращивания, образуя стабильный круг РНК 1,2. Этот процесс может быть опосредован несколькими факторами, включая инвертированные повторяющиеся элементы Alu, присутствующие в восходящем и нисходящем потоке циркуляризированных экзонов, или может быть опосредован некоторыми факторами сплайсинга или РНК-связывающими белками (RBP)2,3. Круговые РНК, генерируемые исключительно из экзонной или интронной последовательности, классифицируются как экзонные циркРНК и циркулярные интронные РНК или ci-РНК, тогда как некоторые экзонные циркРНК сохраняют интрон и называются экзон-интронными циркРНК (EIcircRNAs)3,4. Функции циркРНК многогранны, включая губку миРНК и/или RBP, регулирующую транскрипцию и регулирующую клеточную функцию путем трансляции в пептиды 3,5,6,7. В нескольких докладах подчеркивается значение циркРНК при различных заболеваниях и физиологических процессах8. Кроме того, тканеспецифические паттерны экспрессии и резистентность к перевариванию экзонуклеазы делают ее функциональным биомаркером для диагностики заболеваний, и ее также можно использовать в качестве подходящей терапевтической мишени8. Учитывая его важность в регулировании здоровья и заболеваний, точная количественная оценка экспрессии циркРНК является необходимостью часа.
Было разработано несколько биохимических методов для количественной оценки циркРНК в биологических образцах9. Одним из наиболее удобных и широко распространенных методов количественного определения циркРНК является обратная транскрипция с последующей количественной полимеразной цепной реакцией (RT-qPCR) с использованием дивергентных пар праймеров10. Тем не менее, большинство циркРНК находятся в низком изобилии по сравнению с линейными мРНК, что затрудняет их количественную оценку11. Чтобы преодолеть эту проблему, мы стремились использовать цифровую капельную ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки количества циркРНК в данном образце. dd-PCR – это передовая технология ПЦР, которая следует принципу микрофлюидики; он генерирует несколько водных капель в масле, и ПЦР происходит в каждой капле как индивидуальная реакция12. Реакция возникает в отдельных каплях и анализируется с помощью капельного считывателя, который дает количество положительных или отрицательных капель для интересующего гена12. Это наиболее чувствительный метод точной количественной оценки интересующего гена, даже если в данном образце есть только одна копия. Снижение чувствительности к ингибиторам, лучшая точность и пропуск эталонного гена для количественной оценки делают его более выгодным, чем обычный qPCR 13,14,15. Он широко использовался в качестве исследовательского и диагностического инструмента для абсолютной количественной оценки интересующего гена16,17. Здесь мы описываем подробный протокол dd-PCR для количественной оценки циркРНК в дифференциации миотубок C2C12 мыши и пролиферирующих миобластов C2C12 мыши с использованием расходящихся праймер.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования CircRNA выросли в последнее десятилетие с открытием высокопроизводительных технологий секвенирования. В результате он был рассмотрен как потенциальная молекула для будущей РНК-терапии. Кроме того, известно, что он действует как биомаркер при нескольких заболеваниях, включа…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана внутренним финансированием института наук о жизни, исследовательским грантом DBT (BT/PR27622/MED/30/1961/2018) и стипендией Wellcome Trust/DBT India Alliance Fellowship [IA/I/18/2/504017], присужденной Амарешу К. Панде. Мы благодарим других членов лаборатории за корректуру статьи.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C., Xiao, J. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
