Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi
Summary
Bu protokol, farklı primerler kullanılarak hücrelerdeki dairesel RNA (circRNA) seviyelerinin hassas bir şekilde ölçülmesi için ayrıntılı dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini açıklamaktadır.
Abstract
Dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (dd-PCR) en hassas niceleme yöntemlerinden biridir; reaksiyonu yaklaşık 20.000 yağda su damlacığına ayırır ve PCR bireysel damlacıklarda meydana gelir. dd-PCR, geleneksel gerçek zamanlı qPCR’ye göre, düşük bolluk hedeflerinin tespitinde artan doğruluk, niceleme için referans genleri atlama, numuneler için teknik replikaları ortadan kaldırma ve numunelerdeki inhibitörlere karşı yüksek esneklik gösterme gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Son zamanlarda, dd-PCR, gen ekspresyon analizi ve teşhisi için hedef DNA veya RNA’yı doğru bir şekilde ölçmek için en popüler yöntemlerden biri haline gelmiştir. Dairesel RNA’lar (sirkRNA’lar), 5′ ve 3′ uçları olmayan, yakın zamanda keşfedilen kovalent olarak kapalı RNA moleküllerinin büyük bir ailesidir. RNA bağlayıcı proteinler ve mikroRNA’lar için sünger görevi görerek gen ekspresyonunu düzenledikleri gösterilmiştir. Ayrıca, sirkRNA’lar vücut sıvılarına salgılanır ve ekzonükleazlara karşı dirençleri, hastalık teşhisi için biyobelirteçler olarak hizmet etmelerini sağlar. Bu makale, hücrelerdeki spesifik dairesel RNA (circRNA) seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için farklı primer tasarımı, RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve dd-PCR analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermeyi amaçlamaktadır. Sonuç olarak, dd-PCR kullanarak circRNA’ların kesin niceliğini gösteriyoruz.
Introduction
RNA dizileme teknolojilerindeki son gelişmeler ve yeni hesaplama algoritmaları, dairesel RNA (circRNA)1 olarak adlandırılan, büyüyen kodlamayan RNA ailesinin yeni bir üyesini keşfetti. Adından da anlaşılacağı gibi, sirkRNA’lar, serbest uçları olmayan tek sarmallı RNA moleküllerinin bir ailesidir. Bunlar, yukarı akış ekleme alıcı bölgesinin, kararlı bir RNA çemberi1,2 oluşturmak için aşağı akış ekleme donör bölgesi ile kovalent olarak birleştiği, geri ekleme adı verilen kanonik olmayan baştan kuyruğa ekleme ile oluşturulurlar. Bu süreç, dairesel ekzonların yukarı ve aşağı akımında bulunan ters Alu tekrarlayan elementler de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından aracılık edilebilir veya bazı ekleme faktörleri veya RNA bağlayıcı proteinler (RPP’ler) tarafından aracılık edilebilir2,3. Sadece ekzonik veya intronik diziden üretilen dairesel RNA’lar ekzonik sirkRNA ve dairesel intronik RNA’lar veya ci-RNA’lar olarak sınıflandırılırken, bazı ekzonik sirkRNA’lar introniği korur ve ekzon-intron sirkRNA’lar (EIcircRNA’lar)3,4 olarak adlandırılır. SirkRNA’ların işlevleri, miRNA ve / veya RBP’yi süngerlemek, transkripsiyonu düzenlemek ve peptidlereçevirerek hücresel fonksiyonu düzenlemek de dahil olmak üzere çok yönlüdür 3,5,6,7. Çeşitli raporlar, sirkRNA’ların çeşitli hastalıklarda ve fizyolojik süreçlerdeki önemini vurgulamıştır8. Ayrıca, dokuya özgü ekspresyon paternleri ve ekzonükleaz sindirimine direnç, onu hastalık tanısı için fonksiyonel bir biyobelirteç haline getirir ve uygun bir terapötik hedef olarak da kullanılabilir8. Sağlık ve hastalıkların düzenlenmesindeki önemi göz önüne alındığında, sirkRNA ekspresyonunun doğru bir şekilde ölçülmesi saatin ihtiyacıdır.
Biyolojik örneklerdeki sirkRNA’ları ölçmek için çeşitli biyokimyasal yöntemler geliştirilmiştir9. SirkRNA nicelleştirmesi için en uygun ve yaygın olarak kabul edilen yöntemlerden biri, ters transkripsiyon ve ardından farklı primer çiftleri10 kullanılarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonudur (RT-qPCR). Bununla birlikte, sirkRNA’ların çoğunluğu lineer mRNA’lara kıyasla düşük bolluk içindedir, bu da onları ölçmeyi zorlaştırır11. Bu sorunun üstesinden gelmek için, belirli bir numunedeki sirkRNA sayısını doğru bir şekilde ölçmek için dijital damlacık PCR’yi (dd-PCR) kullanmaya çalıştık. dd-PCR, mikroakışkanlar ilkesini takip eden gelişmiş bir PCR teknolojisidir; yağda birden fazla sulu damlacık üretir ve PCR her damlacıkta ayrı bir reaksiyon12 olarak oluşur. Reaksiyon bireysel damlacıklarda meydana gelir ve ilgilenilen gen için pozitif veya negatif damlacıkların sayısını veren bir damlacık okuyucu kullanılarak analiz edilir12. Belirli bir örnekte yalnızca tek bir kopya olsa bile, ilgilenilen bir geni doğru bir şekilde ölçmek için en hassas tekniktir. İnhibitörlere karşı duyarlılığın azalması, daha iyi hassasiyet ve niceleme için referans genin ihmal edilmesi, onu geleneksel qPCR 13,14,15’ten daha avantajlı hale getirir. İlgilenilen bir genin mutlak nicelleştirilmesi için bir araştırma ve teşhis aracı olarak yaygın olarak kullanılmıştır16,17. Burada, fare C2C12 miyotüplerini ayırt etmede ve farklı primerler kullanarak fare C2C12 miyoblastlarını çoğaltmada sirkRNA nicelemesi için ayrıntılı dd-PCR protokolünü açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
CircRNA araştırması, son on yılda yüksek verimli dizileme teknolojilerinin keşfi ile büyümüştür. Sonuç olarak, gelecekteki RNA terapötikleri için potansiyel bir molekül olarak kabul edilmiştir. Ek olarak, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda biyobelirteç olarak hareket ettiği bilinmektedir 4,8. Bununla birlikte, sirkRNA’nın tanımlanması, düşük bolluğu ve onu ebeveyn mRNA9…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Yaşam Bilimleri Enstitüsü’nden intramural fonlar, DBT araştırma hibesi (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) ve Amaresh C. Panda’ya verilen Wellcome Trust / DBT Hindistan İttifakı Bursu [IA / I / 18 / 2 / 504017] ile desteklenmiştir. Makaleyi düzelttikleri için diğer laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz.
Materials
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C., Xiao, J. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. , 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
