Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi
Summary
Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.
Abstract
L’epatectomia parziale è stata ampiamente utilizzata per studiare la rigenerazione epatica nei topi, ma l’isolamento di alte rese di epatociti vitali per applicazioni a valle di singole cellule è impegnativo. Un marcato accumulo di lipidi all’interno degli epatociti rigeneranti si osserva durante i primi 2 giorni di normale rigenerazione epatica nei topi. Questa cosiddetta steatosi associata alla rigenerazione transitoria (TRAS) è temporanea ma si sovrappone parzialmente alla fase proliferativa principale. La purificazione a gradiente di densità è la spina dorsale della maggior parte dei protocolli esistenti per l’isolamento degli epatociti primari. Poiché la purificazione del gradiente si basa sulla densità e sulla dimensione delle cellule, separa le popolazioni di epatociti non steatotici da quelli steatotici. Pertanto, gli epatociti grassi spesso vengono persi, producendo frazioni epatocitarie non rappresentative.
Il protocollo presentato descrive un metodo semplice e affidabile per l’isolamento in vivo degli epatociti rigeneranti indipendentemente dal loro contenuto lipidico. Gli epatociti di topi maschi C57BL/6 vengono isolati 24-48 ore dopo l’epatectomia mediante un classico approccio di perfusione della collagenasi in due fasi. Una pompa peristaltica standard guida le soluzioni riscaldate attraverso la vena cava inferiore cateterizzata nel resto, utilizzando una tecnica di perfusione retrograda con deflusso attraverso la vena porta. Gli epatociti sono dissociati dalla collagenasi per il loro rilascio dalla capsula di Glisson. Dopo il lavaggio e un’attenta centrifugazione, gli epatociti possono essere utilizzati per eventuali analisi a valle. In conclusione, questo articolo descrive una tecnica semplice e riproducibile per l’isolamento di una popolazione rappresentativa di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi. Il metodo può anche aiutare lo studio della malattia del fegato grasso.
Introduction
Il fegato può rigenerarsi anche dopo una grave perdita di tessuto. Questa capacità rigenerativa unica è esplicitamente illustrata dal modello sperimentale di epatectomia parziale (70%), descritto per la prima volta nei ratti da Higgins e Anderson nel 19311. In questo modello, il 70% del fegato viene rimosso chirurgicamente dagli animali tagliando i lobi del fegato più grandi. I lobi rimanenti crescono quindi attraverso l’ipertrofia compensatoria per ripristinare la massa epatica originale entro circa 1 settimana dopo l’intervento chirurgico, anche se senza ripristino dell’architettura epatica originale 2,3. Sono state sviluppate ulteriori epatectomie con quantità variabili di rimozione tissutale, come l’epatectomia estesa all’86% in cui il residuo epatico è troppo piccolo per recuperare, portando infine a insufficienza epatica postepatectomia (PHLF) e successiva morte nel 30% -50% degli animali 4,5,6. Questi modelli consentono lo studio della rigenerazione epatica normale e fallita, a seconda della quantità di tessuto resecato (Figura 1).
Sebbene i modelli murini di epatectomie siano stati utilizzati con successo per molti anni, solo recentemente i metodi analitici più avanzati hanno permesso una visione più approfondita a livello di singola cellula. Per la maggior parte di questi metodi, tuttavia, la presenza di singoli epatociti è un prerequisito di base. La maggior parte dei protocolli per l’isolamento degli epatociti primari si basano su una tecnica di perfusione della collagenasi in due fasi e sulla successiva purificazione del gradiente di densità per separare gli epatociti vitali dai detriti e dalle cellule morte non parenchimali, nonché dalle cellule morte 7,8,9. Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Berry e Friend nel 196910 e adattato da Seglen e colleghi nel 197211,12. Tuttavia, poiché la centrifugazione a gradiente si basa sulla densità e sulle dimensioni delle cellule, gli epatociti carichi di lipidi vengono spesso persi durante la purificazione standard. Mentre tale perdita può essere trascurabile per molte domande di ricerca, è un aspetto cruciale per la rigenerazione precoce del fegato. Durante i primi 2 giorni, gli epatociti all’interno del fegato di topo rigenerante accumulano lipidi, crescendo così di dimensioni e diminuendo in densità. Questa steatosi associata alla rigenerazione transitoria (TRAS) serve a fornire carburante rigenerativo ed è temporanea, ma si sovrappone parzialmente alla fase proliferativa principale ed è distribuita in modo non uniforme all’interno dei lobuli epatici – le unità funzionali del fegato13,14. Dopo l’epatectomia estesa all’86%, tuttavia, si verifica anche TRAS ma persiste, perché la rigenerazione è in stallo e i lipidi non vengono ossidati14. Pertanto, la purificazione a gradiente degli epatociti dopo epatectomie al 70% o all’86% produrrà frazioni non rappresentative, poiché la maggior parte degli epatociti carichi di lipidi viene persa a causa della loro bassa densità15.
In questo protocollo di isolamento modificato, gli epatociti di topi C57BL/6 vengono isolati 24-48 ore dopo l’epatectomia mediante un classico approccio di perfusione della collagenasi in due fasi. Di solito, l’incannulamento e la perfusione del residuo per l’isolamento cellulare vengono eseguiti tramite la vena porta. Tuttavia, la resistenza portovascolare nei piccoli resti lasciati dopo la resezione maggiore è alta16, e quindi la perfusione è delicata. Poiché la vena cava rimane inalterata dalle epatectomie, la perfusione può essere facilmente eseguita in direzione retrograda tramite incannulamento della vena cava. Una pompa peristaltica standard guida le soluzioni riscaldate attraverso la vena cava inferiore cateterizzata nel residuo epatico, utilizzando la perfusione retrograda con deflusso attraverso la vena porta (Figura supplementare S1). Gli epatociti sono dissociati dalle collagenasi e rilasciati dalla capsula di Glisson. Dopo il lavaggio e l’attenta lavorazione degli epatociti vitali mediante isolamento graduale utilizzando un approccio di centrifugazione a bassa velocità, gli epatociti possono essere utilizzati per qualsiasi analisi a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo pubblicato fornisce un metodo affidabile e diretto per isolare un’alta resa di epatociti murini normali e steatotici per analisi a valle a singola cellula o analisi di massa di cellule dopo la selezione FACS. Il netto vantaggio rispetto alla purificazione del gradiente di densità è che il contenuto lipidico cellulare non ha essenzialmente alcun impatto sulla resa effettiva degli epatociti. Pertanto, la frazione di epatociti steatosici sarà mantenuta e inclusa nelle analisi a valle. Questo non è solo cru…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (sovvenzione 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
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