3次元細胞外マトリックスでのIDG-SW3細胞培養
Summary
ここでは、IDG-SW3細胞を3次元(3D)細胞外マトリックスで培養するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
骨細胞は、骨芽細胞から末端分化している非増殖性細胞であると考えられています。骨細胞外マトリックス(骨骨)に埋め込まれた骨芽細胞は、 Pdpn 遺伝子を発現して細胞樹状突起を形成し、骨前細胞に変化します。その後、骨前細胞は Dmp1 遺伝子を発現してマトリックスの石灰化を促進し、それによって成熟した骨細胞に変化します。このプロセスは骨細胞形成と呼ばれます。IDG-SW3は、骨細胞形成の in vitro 研究でよく知られている細胞株です。以前の多くの方法では、コラーゲンIを培養マトリックスの主成分または唯一の成分として使用していました。しかし、オステオイドには、コラーゲンIに加えて、細胞の成長、接着、移動を促進する重要な成分である粉砕物質も含まれています。さらに、マトリックス物質は透明であるため、I型コラーゲンゲルの透明性が高まり、イメージング技術による樹状突起形成の探索に役立ちます。したがって、この論文では、IDG-SW3の生存のためにコラーゲンIとともに細胞外マトリックスを使用して3Dゲルを確立するためのプロトコルを詳述します。この研究では、骨細胞形成中の樹状突起の形成と遺伝子発現を分析しました。7日間の骨形成培養後、蛍光共焦点顕微鏡下で広範囲の樹状突起ネットワークが明瞭に観察されました。リアルタイムPCRでは、 Pdpn と Dmp1 のmRNAレベルが3週間連続的に上昇していることが示されました。4週目に、実体顕微鏡で鉱物粒子を充填した不透明なゲルが発見され、蛍光X線(XRF)アッセイと一致しました。これらの結果は、この培養マトリックスが骨芽細胞から成熟骨細胞への移行をうまく促進することを示しています。
Introduction
骨細胞は、骨芽細胞に由来する末端分化細胞である1,2。骨芽細胞は、骨骨に埋もれると骨細胞形成を行い、骨前細胞を形成するPdpn遺伝子、骨を石灰化するDmp1遺伝子、骨組織において成熟骨細胞として機能するSost遺伝子とFgf23遺伝子を発現する3。ここでは、骨細胞形成プロセスにおける樹状突起の伸長とマーカー遺伝子発現を同定するために、3D培養システムを導入します。
IDG-SW3細胞は、トランスジェニックマウスに由来する不死化初代細胞株であり、異なる培地で培養すると、骨芽細胞を増殖または複製して骨細胞分化を遅らせることができます4。MLO-A5、MLO-Y4、および他の細胞株と比較して、IDG-SW3細胞における機能性タンパク質の発現プロファイル、カルシウム塩沈着を行う能力、および各種ホルモンに対する応答は、骨組織における初代骨細胞のそれと同じである可能性が高い4。
2Dシステムと比較して、3D培養システムは、栄養素の勾配、低い機械的剛性、周囲の機械的範囲など、in vivoの細胞増殖環境を模倣する能力が高くなります(表1)。3Dシステムで骨芽細胞を培養する以前の方法のほとんどは、コラーゲンI線維がカルシウムおよびリンの沈着部位として機能するため、製剤4,5,6の固有の成分としてコラーゲンIを使用していました。しかし、骨骨に不可欠な構成要素である細胞外マトリックスには、細胞の成長、接着、遊走を促進する細胞因子が多数含まれており7,8、透明で画像観察に便利です。従って、このプロトコルはosteocytogenesisの調査のための二次部品としてMatrigel (以下基底の膜のマトリックスと言われる)を使用する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの重要な点は、自然凝固を防ぐために、ステップ1とステップ2を氷上で実行する必要があることです。この方法では、コラーゲンIの最終濃度は1.2mg/mLであった。したがって、最適なddH2O体積は、さまざまなメーカーのさまざまなコラーゲンと一致するように計算する必要があります。
生体内では、骨細胞形成は、骨芽細胞の表面から海綿骨?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IDG-SW3細胞株を寄贈してくださったLynda F. Bonewald博士に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(82070902、82100935、81700778)と上海「科学技術革新」セーリングプロジェクト(21YF1442000)の支援を受けました。
Materials
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
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