IDG-SW3 cellekultur i en tredimensjonal ekstracellulær matrise

Summary

Her presenterer vi en protokoll for dyrking av IDG-SW3-celler i en tredimensjonal (3D) ekstracellulær matrise.

Abstract

Osteocytter anses å være ikke-proliferative celler som er terminalt differensiert fra osteoblaster. Osteoblaster innebygd i beinets ekstracellulære matriks (osteoid) uttrykker Pdpn-genet for å danne cellulære dendritter og transformere til preosteocytter. Senere uttrykker preosteocytter Dmp1-genet for å fremme matriksmineralisering og derved transformere til modne osteocytter. Denne prosessen kalles osteocytogenese. IDG-SW3 er en velkjent cellelinje for in vitro-studier av osteocytogenese. Mange tidligere metoder har brukt kollagen I som hovedkomponent eller eneste komponent i dyrkingsmatrisen. Men i tillegg til kollagen I inneholder osteoiden også et grunnstoff, som er en viktig komponent for å fremme cellulær vekst, vedheft og migrasjon. I tillegg er matriksstoffet gjennomsiktig, noe som øker gjennomsiktigheten av kollagen I-formet gel og dermed hjelper utforskningen av dendrittdannelse gjennom avbildningsteknikker. Dermed beskriver dette papiret en protokoll for å etablere en 3D-gel ved hjelp av en ekstracellulær matrise sammen med kollagen I for IDG-SW3-overlevelse. I dette arbeidet ble dendrittdannelse og genuttrykk analysert under osteocytogenese. Etter 7 dager med osteogen kultur ble et omfattende dendrittnettverk tydelig observert under et fluorescens konfokalmikroskop. Sanntids PCR viste at mRNA-nivåene av Pdpn og Dmp1 kontinuerlig økte i 3 uker. I uke 4 avslørte stereomikroskopet en ugjennomsiktig gel fylt med mineralpartikler, i samsvar med røntgenfluorescensanalysen (XRF). Disse resultatene indikerer at denne kulturmatrisen vellykket letter overgangen fra osteoblaster til modne osteocytter.

Introduction

Osteocytter er terminalt differensierte celler avledet fra osteoblaster ^1,2. Når osteoblasten er begravet av osteoiden, gjennomgår den osteocytogenese og uttrykker Pdpn-genet for å danne preosteocytter, Dmp1-genet^{for å mineralisere osteoiden} og Sost– og Fgf23-gener for å fungere som en moden osteocyt i beinvev³. Her introduseres et 3D-dyrkingssystem for å identifisere dendrittforlengelse og markørgenuttrykk i osteocytogeneseprosessen.

IDG-SW3-celler er en udødeliggjort primærcellelinje avledet fra transgene mus og kan utvide eller replikere osteoblast til sen osteocytdifferensiering når de dyrkes i forskjellige medier⁴. Sammenlignet med MLO-A5, MLO-Y4 og andre cellelinjer, er ekspresjonsprofilen til funksjonelle proteiner, evnen til å utføre kalsiumsaltavsetning og responsene på forskjellige hormoner i IDG-SW3-celler mer sannsynlig å være de samme som for primære osteocytter i beinvevet⁴.

Sammenlignet med 2D-systemer er 3D-dyrkingssystemer bedre i stand til å etterligne det in vivo cellulære vekstmiljøet, inkludert næringsgradienten, lav mekanisk stivhet og omkringliggende mekanisk område (tabell 1). De fleste av de tidligere metodene for dyrking av osteoblastiske celler i et 3D-system brukte kollagen I som den unike komponenten i formuleringer ^4,5,6, fordi kollagen I-fibre tjener som stedet for kalsium- og fosforavsetning. Imidlertid inneholder en uunnværlig bestanddel i osteoid, den ekstracellulære matrisen, en stor gruppe cellulære faktorer som fremmer cellulær vekst, vedheft og migrasjon ^7,8 og er gjennomsiktig og praktisk for bildeobservasjon. Dermed bruker denne protokollen Matrigel (heretter referert til som kjellermembranmatrise) som en sekundær komponent for osteocytogenesestudien.

Protocol

Denne protokollen er egnet for dyrking av celler i fire brønner med 24-brønnplater. Ved tilberedning av flere prøver eller plater bør mengden av reagensene økes tilsvarende. 1. Fremstilling av kollagen I-blandingen MERK: Kollagen I og kjellermembranmatriksgel raskt ved romtemperatur. Kollagen bør derfor håndteres på is (2 °C til 8 °C). Alle tips og rør som brukes må være forkjølt med mindre annet er angitt. Alle prosedyrene skal utføres…

Representative Results

Etter farging av levende/døde celler ble cellene visualisert ved hjelp av et konfokal lasermikroskop. Alle cellene var kalcein AM-positive (grønn farge), og det var nesten ingen EthD-1-positive celler (rød farge) i feltet, noe som indikerer at gelsystemet laget med denne metoden er svært egnet for osteocytogenese (figur 1A, til venstre). For bedre å bestemme den romlige fordeling av cellene ble det valgt et pseudofargebilde for å vise celledendrittene på forskjellige dybder av gelen; …

Discussion

Et kritisk punkt i denne protokollen er at trinn 1 og trinn 2 må utføres på is for å forhindre spontan koagulasjon. I denne metoden var den endelige konsentrasjonen av kollagen I 1,2 mg / ml. Dermed bør et optimalt ddH₂O-volum beregnes for å matche de forskjellige kollagenene fra forskjellige produsenter.

In vivo involverer osteocytogenese en polar bevegelse av osteoblaster fra overflaten til det indre av trabekulært bein¹⁴. Denne protokollen …

Materials

0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid	Hyclone	SH30042.01
15 mL tubes	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
ascorbic acid	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
Collagen I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogenizer	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
laser confocal fluorescence microscopy	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
Live/Dead Cell Imaging kit	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel matrix	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X), no glutamine	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.FS
stereo microscope	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X-ray fluorescence	EDAX, USA	EAGLE III
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422