Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het differentiëren van hiPSC’s in oogveldclusters en het genereren van neuro-retinale organoïden met behulp van vereenvoudigde kweekomstandigheden waarbij zowel adherente als suspensiecultuursystemen betrokken zijn. Andere oculaire celtypen, zoals de RPE en het hoornvliesepitheel, kunnen ook worden geïsoleerd uit volwassen oogvelden in retinale culturen.
Pluripotente stamcellen kunnen complexe weefselorganoïden genereren die nuttig zijn voor in vitro ziektemodelleringsstudies en voor het ontwikkelen van regeneratieve therapieën. Dit protocol beschrijft een eenvoudigere, robuuste en stapsgewijze methode voor het genereren van retinale organoïden in een hybride kweeksysteem bestaande uit adherente monolaagculturen gedurende de eerste 4 weken van retinale differentiatie tot het ontstaan van verschillende, zelfgeorganiseerde oogveld primordiale clusters (EFP’s). Verder worden de donutvormige, cirkelvormige en doorschijnende neuro-retinale eilanden binnen elke EFP handmatig geplukt en gekweekt onder suspensie met behulp van niet-hechtende kweekschalen in een retinale differentiatiemedium gedurende 1-2 weken om meerlagige 3D-optische cups (OC-1M) te genereren. Deze onrijpe retinale organoïden bevatten PAX6+ en ChX10+ prolifererende, multipotente retinale voorlopers. De voorlopercellen zijn lineair zelf geassembleerd binnen de organoïden en verschijnen als verschillende radiale strepen. Na 4 weken na suspensiecultuur ondergaan de retinale voorlopers post-mitotische arrestatie en afstammingsdifferentiatie om volwassen retinale organoïden (OC-2M) te vormen. De fotoreceptorlijn gebonden voorlopers ontwikkelen zich binnen de buitenste lagen van retinale organoïden. Deze CRX+ en RCVRN+ fotoreceptorcellen rijpen morfologisch om binnenste segmentachtige extensies weer te geven. Deze methode kan worden toegepast voor het genereren van retinale organoïden met behulp van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s). Alle stappen en procedures worden duidelijk uitgelegd en gedemonstreerd om repliceerbaarheid te garanderen en voor bredere toepassingen in fundamentele wetenschap en translationeel onderzoek.
Het netvlies is een lichtgevoelig weefsel aan de achterkant van het gewervelde oog dat lichtsignalen omzet in zenuwimpulsen door een biochemisch fenomeen dat bekend staat als de fototransductieroute. De initiële zenuwimpulsen die in de fotoreceptorcellen van het netvlies worden gegenereerd, worden getransduceerd naar andere retinale interneuronen en retinale ganglioncellen (RGC’s) en bereiken de visuele cortex van de hersenen, wat helpt bij beeldperceptie en visuele respons.
Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) zijn naar schatting 1,5 miljoen kinderen blind, waarvan 1 miljoen in Azië. Erfelijke retinale dystrofie (IRD) is een belangrijke blinderende ziekte die 1 op de 4.000 personen wereldwijd treft 1,2,3, terwijl de prevalentie van blindheid geassocieerd met leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) varieert van 0,6% –1,1% in ontwikkelingslanden 4. IRD’s worden veroorzaakt door erfelijke genetische defecten in meer dan 300 verschillende genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling en functie van het netvlies5. Dergelijke genetische veranderingen resulteren in de verstoring van normale retinale functies en geleidelijke degeneratie van retinale cellen, namelijk de fotoreceptorcellen en het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE), wat leidt tot ernstig verlies van het gezichtsvermogen en blindheid. Er is enorme vooruitgang geboekt in andere verblindende aandoeningen met betrekking tot het hoornvlies, de lens, enz. Retinale dystrofieën en oogzenuwatrofieën hebben tot op heden echter geen bewezen therapie. Aangezien een volwassen menselijk netvlies geen stamcellenheeft 6, kunnen alternatieve bronnen zoals embryonale stamcellen (SER’s) en patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) een onbeperkte voorraad van gewenste celtypen bieden en een grote belofte inhouden voor het ontwikkelen van complexe weefselorganoïden die nodig zijn voor in vitro ziektemodelleringsstudies en voor het ontwikkelen van regeneratieve therapieën7, 8,9,10.
Enkele jaren van netvliesonderzoek hebben geleid tot een beter begrip van moleculaire gebeurtenissen die de vroege retinale ontwikkeling orkestreren. De meeste protocollen om retinale cellen en 3D-organoïden uit PSC’s te genereren, hebben tot doel deze ontwikkelingsgebeurtenissen in vitro samen te vatten, door de cellen te kweken in een complexe cocktail van groeifactoren en kleine moleculen om de bekende biologische processen stapsgewijs te moduleren. De aldus gegenereerde retinale organoïden bestaan uit belangrijke retinale cellen: retinale ganglioncellen (RGC’s), interneuronen, fotoreceptoren en retinaal gepigmenteerd epitheel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Ondanks succesvolle pogingen om IRD’s te modelleren met behulp van retinale organoïden, vormt de behoefte aan de complexe cocktail van groeifactoren en kleine moleculen tijdens differentiatie en de relatief lage efficiëntie van retinale organoïde generatie een grote uitdaging bij de meeste protocollen. Ze omvatten voornamelijk de vorming van embryoïde lichamen, gevolgd door hun stapsgewijze differentiatie in retinale afstammingslijnen met behulp van complexe kweekomstandigheden in verschillende stadia van in vitro ontwikkeling20,21,22.
Hier wordt een vereenvoudigde en robuuste methode gerapporteerd voor het ontwikkelen van complexe 3D neuro-retinale organoïden uit gezonde controle en retinale ziekte-specifieke hiPSC’s. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van directe differentiatie van bijna-confluente hiPSC-culturen zonder dat embryoïde lichaamsvorming nodig is. Ook is de complexiteit van het kweekmedium vereenvoudigd, waardoor het een kosteneffectieve en reproduceerbare techniek is die gemakkelijk door nieuwe onderzoekers kan worden overgenomen. Het gaat om een hybride kweeksysteem bestaande uit aanhangende monolaagculturen gedurende de eerste 4 weken van retinale differentiatie tot het ontstaan van verschillende, zelfgeorganiseerde oogveld primordiale clusters (EFP’s). Verder worden de cirkelvormige neuro-retinale eilanden binnen elke EFP handmatig geplukt en gekweekt in suspensieculturen gedurende 1-2 weken om meerlagige 3D-retinale cups of organoïden te bereiden die bestaan uit PAX6 + en CHX10 + prolifererende neuro-retinale voorlopers. Uitgebreide kweek van retinale organoïden in 100 μM Taurine-bevattend medium gedurende nog eens 4 weken resulteerde in de opkomst van RCVRN + en CRX + fotoreceptorvoorlopers en volwassen cellen met rudimentaire binnenste segmentachtige extensies.
hiPSC’s zijn een krachtig hulpmiddel om orgaan- en weefselontwikkeling in vitro te bestuderen. Het samenvatten van het fenotype van de ziekte door gezonde versus ziektespecifieke hiPSC’s te differentiëren in de richting van de retinale afstamming kan helpen bij het verkrijgen van nieuwere inzichten in de pathofysiologie van verschillende vormen van erfelijke retinale dystrofieën. Verschillende protocollen zijn beschreven en aangenomen voor de in vitro differentiatie van PSC’s in retinale celtypen. De …
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen de wetenschappelijke en technische ondersteuning van Dr. Chitra Kannabiran, geneticus; Dr. Subhadra Jalali, retinale consultant; Dr. Milind Naik, Oculoplastisch Chirurg; en Dr. Swathi Kaliki, oculaire oncoloog aan het LV Prasad Eye Institute, Hyderabad naar het genereren van normale en patiëntspecifieke iPSC-lijnen. De auteurs erkennen de R&D-subsidies van de Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) en Senior Research Fellowships van ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) en CSIR (V.K.P.), Government of India.
0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |