Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Augenfeld-Cluster und zur Erzeugung neuro-retinaler Organoide unter Verwendung vereinfachter Kulturbedingungen, die sowohl adhärente als auch Suspensionskultursysteme umfassen. Auch andere Augenzelltypen, wie das RPE und das Hornhautepithel, können aus reifen Augenfeldern in Netzhautkulturen isoliert werden.
Pluripotente Stammzellen können komplexe Gewebeorganoide erzeugen, die für In-vitro-Studien zur Modellierung von Krankheiten und für die Entwicklung regenerativer Therapien nützlich sind. Dieses Protokoll beschreibt eine einfachere, robuste und schrittweise Methode zur Erzeugung retinaler Organoide in einem hybriden Kultursystem, das aus adhärenten Monolayerkulturen besteht, während der ersten 4 Wochen der Netzhautdifferenzierung bis zum Auftreten von ausgeprägten, selbstorganisierten Augenfeld-Primordialclustern (EFPs). Darüber hinaus werden die Donut-förmigen, kreisförmigen und transluzenten neuro-retinalen Inseln innerhalb jedes EFP manuell gepflückt und unter Verwendung von nicht-adhärenten Kulturschalen in einem retinalen Differenzierungsmedium für 1-2 Wochen kultiviert, um mehrschichtige 3D-Optikschalen (OC-1M) zu erzeugen. Diese unreifen retinalen Organoide enthalten PAX6+ und ChX10+ proliferierende, multipotente retinale Vorläufer. Die Vorläuferzellen sind innerhalb der Organoide linear selbstorganisiert und erscheinen als ausgeprägte radiale Streifen. 4 Wochen nach der Suspensionskultur durchlaufen die retinalen Vorläuferzellen einen postmitotischen Arrest und eine Abstammungsdifferenzierung, um reife retinale Organoide (OC-2M) zu bilden. Die Vorläufer der Photorezeptorlinie entwickeln sich in den äußersten Schichten der retinalen Organoide. Diese CRX+- und RCVRN+-Photorezeptorzellen reifen morphologisch heran und zeigen innere segmentartige Fortsätze. Diese Methode kann zur Erzeugung retinaler Organoide unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) eingesetzt werden. Alle Schritte und Verfahren werden klar erklärt und demonstriert, um die Replizierbarkeit zu gewährleisten und für breitere Anwendungen in der Grundlagenforschung und translationalen Forschung zu sorgen.
Die Netzhaut ist ein lichtempfindliches Gewebe im hinteren Teil des Wirbeltierauges, das Lichtsignale durch ein biochemisches Phänomen, das als Phototransduktionsweg bekannt ist, in Nervenimpulse umwandelt. Die anfänglichen Nervenimpulse, die in den Photorezeptorzellen der Netzhaut erzeugt werden, werden an andere retinale Interneuronen und retinale Ganglienzellen (RGCs) weitergeleitet und erreichen den visuellen Kortex des Gehirns, was bei der Bildwahrnehmung und der visuellen Reaktion hilft.
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind schätzungsweise 1,5 Millionen Kinder blind, davon 1 Million in Asien. Die erbliche Netzhautdystrophie (IRD) ist eine schwere Erblindungserkrankung, von der weltweit 1 von 4.000 Personen betroffen ist 1,2,3, während die Prävalenz der Erblindung im Zusammenhang mit altersbedingter Makuladegeneration (AMD) in Entwicklungsländern zwischen 0,6 % und 1,1 % liegt 4. IRDs werden durch vererbte genetische Defekte in über 300 verschiedenen Genen verursacht, die an der Entwicklung und Funktion der Netzhaut beteiligt sind5. Solche genetischen Veränderungen führen zu einer Störung der normalen Netzhautfunktionen und einer allmählichen Degeneration der Netzhautzellen, nämlich der Photorezeptorzellen und des retinalen Pigmentepithels (RPE), was zu schwerem Sehverlust und Erblindung führt. Enorme Fortschritte wurden bei anderen Erblindungszuständen erzielt, die die Hornhaut, die Linse usw. betreffen. Für Netzhautdystrophien und Sehnervenatrophien gibt es bisher jedoch keine bewährte Therapie. Da eine erwachsene menschliche Netzhaut keine Stammzellenbesitzt 6, können alternative Quellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) und patienteneigene induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) einen unbegrenzten Vorrat an gewünschten Zelltypen bereitstellen und sind vielversprechend für die Entwicklung komplexer Gewebeorganoide, die für In-vitro-Studien zur Modellierung von Krankheiten und für die Entwicklung regenerativer Therapien erforderlich sind7. 8,9,10.
Mehrere Jahre Netzhautforschung haben zu einem besseren Verständnis der molekularen Ereignisse geführt, die die frühe Entwicklung der Netzhaut orchestrieren. Die meisten Protokolle zur Erzeugung von Netzhautzellen und 3D-Organoiden aus PSCs zielen darauf ab, diese Entwicklungsereignisse in vitro zu rekapitulieren, indem die Zellen in einem komplexen Cocktail aus Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen kultiviert werden, um die bekannten biologischen Prozesse schrittweise zu modulieren. Die so erzeugten retinalen Organoide bestehen aus den wichtigsten Netzhautzellen: retinalen Ganglienzellen (RGCs), Interneuronen, Photorezeptoren und retinalem pigmentiertem Epithel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Trotz erfolgreicher Versuche, IRDs mit retinalen Organoiden zu modellieren, stellt die Notwendigkeit des komplexen Cocktails aus Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen während der Differenzierung und die relativ geringe Effizienz der retinalen Organoidgenerierung eine große Herausforderung für die meisten Protokolle dar. Sie beinhalten hauptsächlich die Bildung von Embryoidkörpern, gefolgt von ihrer schrittweisen Differenzierung in retinale Linien unter Verwendung komplexer Kulturbedingungen in verschiedenen Stadien der In-vitro-Entwicklung 20,21,22.
In dieser Arbeit wird über eine vereinfachte und robuste Methode zur Entwicklung komplexer 3D-Neuro-Retina-Organoide aus gesunden Kontroll- und Netzhauterkrankungs-spezifischen hiPS-Zellen berichtet. Das hier beschriebene Protokoll nutzt die direkte Differenzierung von nahezu konfluenten hiPSC-Kulturen, ohne dass eine Embryoidkörperbildung erforderlich ist. Außerdem wird die Komplexität des Nährmediums vereinfacht, was es zu einer kostengünstigen und reproduzierbaren Technik macht, die von neuen Forschern leicht übernommen werden kann. Es handelt sich um ein hybrides Kultursystem, das aus adhärenten Monolayer-Kulturen während der ersten 4 Wochen der Netzhautdifferenzierung bis zur Entstehung von ausgeprägten, selbstorganisierten Augenfeld-Primordial-Clustern (EFPs) besteht. Darüber hinaus werden die zirkulären neuro-retinalen Inseln innerhalb jedes EFP manuell gepflückt und für 1-2 Wochen in Suspensionskulturen gezüchtet, um mehrschichtige 3D-Netzhautschalen oder Organoide herzustellen, die aus PAX6+ und CHX10+ proliferierenden neuroretinalen Vorläufern bestehen. Eine ausgedehnte Kultivierung von retinalen Organoiden in 100 μM taurinhaltigem Medium für weitere 4 Wochen führte zur Entstehung von RCVRN+ und CRX+ Photorezeptorvorläufern und reifen Zellen mit rudimentären inneren segmentartigen Fortsätzen.
hiPS-Zellen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Entwicklung von Organen und Geweben in vitro zu untersuchen. Die Rekapitulation des Krankheitsphänotyps durch die Unterscheidung gesunder und krankheitsspezifischer hiPS-Zellen gegenüber der Netzhautlinie kann dazu beitragen, neuere Einblicke in die Pathophysiologie verschiedener Formen vererbter Netzhautdystrophien zu gewinnen. Für die in vitro Differenzierung von PSCs in retinale Zelltypen wurden mehrere Protokolle beschrieben und angewendet. …
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich für die wissenschaftliche und technische Unterstützung durch Dr. Chitra Kannabiran, Genetiker; Dr. Subhadra Jalali, Fachärztin für Netzhaut; Dr. Milind Naik, Okuloplastischer Chirurg; und Dr. Swathi Kaliki, Augenonkologe am LV Prasad Eye Institute, Hyderabad, bei der Erzeugung normaler und patientenspezifischer iPSC-Leitungen. Die Autoren würdigen die F&E-Zuschüsse des Science and Engineering Research Board, des Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), des Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) sowie die Senior Research Fellowships von ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) und CSIR (V.K.P.), der indischen Regierung.
0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |